Name: methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Les auteurs remercient la Fondation Bill et Melinda Gates pour son appui au développement de la technologie et de la formation.

Remarque: Ce protocole comprend les volumes et les concentrations pour plaque à 96 puits, les bandes 8 à tubes, et des systèmes à base capillaires (volume réactionnel de 10 ul); cependant, HRM peut également être effectuée dans des systèmes à base de plaque 384 puits avec un volume réactionnel de 5 ul par mise à l&#39;échelle correspondante, tous les volumes. La gamme de détection pour la plupart des systèmes est de 10 pg à ADN matrice 10 ng. 1. Préparer des modèles <ol><li> Plasmodium falciparum obtenir des échantillons directement à partir de sang obtenu à partir de patients participant aux études de sites sur le terrain et stockées sous forme de sang total, des globules rouges granulés, ou sur du papier filtre. Note: Les échantillons peuvent également être adaptés à la culture croître in vitro; certaines souches de laboratoire standard pour l&#39;analyse peuvent être commandés à partir du paludisme Réactif de recherche et de référence Resource Center (MR4, les échantillons peuvent être utilisés directement à partir de cultures de cellules ou de globules rouges en granulés ou extraites de sang total, globules rouges, ou papier filtre. </li><li> ADN extrait à partir depapier filtre ou des souches de culture adapté Remarque: HRM est sensible à la concentration de sel; concentration différences dues à des méthodes d&#39;extraction de variables peuvent affecter de manière significative les températures de fusion. Alors que les tampons finales spécifiques ne sont pas un facteur important pour le succès, utiliser une élution ou la remise en suspension tampon standard commun (par exemple, l&#39;eau, 1x Te [«faible Te» ou «tampon de suspension de l&#39;ADN&quot;: 10 mM Tris-Cl, EDTA 0,10] ou 1x TE [10 mM de Tris-Cl, 1 mM d&#39;EDTA]) pour tous les échantillons à éviter des courbes de fusion anormales ou incohérentes. <ol><li> Préparer des dilutions de modèle de 10 pg -10 ng par ml dans la norme Te, TE, ou de l&#39;eau pour chaque réaction de 10 ul. </li></ol></li><li> Amplification directe de globules rouges granulés <ol><li> Déterminer la parasitémie de globules rouges en utilisant la microscopie des frottis mince Remarque: Les méthodes pour déterminer la parasitémie de globules rouges infectés sont disponibles auprès des Centers for Disease Control and Prevention (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Diluer parasitémie supérieure à 0,5% 1: 400 dans la PCR de qualité de l&#39;eau, TE, ou Te. Utilisez 3 pi pour chaque réaction 5- 10 pi. </li></ol></li><li> Contrôles Remarque: HRM peut être utilisé pour un balayage pour détecter des gènes variants de séquence 12 dans une population; Toutefois, le génotypage précise exige des normes séquence-vérifié pour contenir le SNP interrogé. Constructions plasmide ou le paludisme isolats avec des génotypes connus peuvent être utilisés. Pour la plupart des applications, 3D7 (MR4 ARM-151) est utilisé comme un contrôle de type sauvage. En raison de la variabilité inter-séries, toujours inclure des contrôles positifs et négatifs. <ol><li> Les contrôles positifs: Préparer 10 pg - 10 ng par 1 pi des dilutions de plasmide ou de normes avec des génotypes SNP-séquence vérifiée. </li><li> Contrôle négatif: l&#39;eau de qualité PCR utilisation comme un contrôle sans matrice (NTC) pour les réactions d&#39;amplification. </li></ol></li></ol>&quot;&gt; Amplification PCR ve_title 2. <ol><li> Préparer mélange réactionnel <ol><li> (Facultatif) Mineral couche d&#39;huile. Remarque: Certains systèmes de GRH sont les plates-formes de fusion autonomes et ne pas avoir un couvercle chauffé pour éviter la condensation et l&#39;évaporation produit pendant l&#39;amplification. <ol><li> Ajouter 20 ul huile minérale légère à chaque plaque bien avant de charger le mélange réactionnel. </li></ol></li><li> Préparer 10x les stocks de travail de tous les essais <ol><li> Reportez-vous au tableau 1 pour 10x concentrations d&#39;achat d&#39;actions de travail recommandées ainsi que des concentrations finales de génotypage de GRH base-sonde bloqué. </li></ol></li><li> Préparer des mélanges réactionnels <ol><li> Pour chaque puits dans une plaque ou un tube, ajoutez 1 ul 10x stock de travail avant et arrière amorces et des sondes, 4.0 - 2.5x ou 2.0x GRH Master Mix 5.0 pi, 1 modèle de pi, et de l&#39;eau de qualité PCR pour un volume total de réaction de 10 ul . </li></ol></li><li> Plaques ou des tubes de couverture <ol><li> Utilisez optique plaque seals pour l&#39;amplification basée sur plaque, casquettes optiques pour les systèmes basés sur la bande-tubes et bouchons en plastique pour les systèmes à base de capillaires. Soyez sûr couverture est complète et les plaques et les bouchons sont complètement étanche et sécurisé pour empêcher l&#39;évaporation pendant l&#39;amplification. </li></ol></li><li> Des échantillons de spin <ol><li> Plaques Spin 3 min à 1800 xg pour éliminer les bulles d&#39;air et de séparer les phases huileuse et aqueuse, si l&#39;huile minérale est utilisée. </li></ol></li></ol></li><li> Protocole d&#39;amplification <ol><li> Placer des plaques ou des tubes réactionnels dans thermocycleur. Protocoles sonde bloqué ou MAAB amplification standards Run (tableaux 2 et 3, respectivement). Notez la différence de température de recuit entre ces méthodes. </li></ol></li></ol> 3. Analyse de la GRH <ol><li> Faire fondre <ol><li> Après amplification par PCR, procéder à l&#39;analyse de fusion. Pour les systèmes autonomes de fusion qui ne ont pas intégré dans l&#39;amplification (par exemple, des systèmes. BioFire Défense LightScanner), redéplacer la plaque amplifié à partir de cycleur thermique et le lieu de l&#39;instrument de gestion des ressources humaines. Depuis l&#39;interface du logiciel système, faire fondre la plaque de 40 à 80 ° C pour produire les deux sondes et amplicons pics de fusion. Remarque: Pour enregistrer fusion et analyse temps, la fenêtre de fusion peut être raccourcie pour couvrir des plages de température pour seulement sonder ou régions amplicon de fusion. Après fusion, les plaques et les tubes peuvent être re-fondre si nécessaire et stockés à -20 ° C ou 4 ° C. Des tubes de verre de magasin seulement à 4 ° C pour empêcher les tubes de craquage. </li></ol></li><li> Analyse Melt <ol><li> Retirer les échantillons négatifs <ol><li> Dans le logiciel d&#39;analyse, de supprimer d&#39;autres échantillons d&#39;analyse qui ne sont pas amplifier ou qui ont des pics de fusion en escalier. Remarque: après avoir sélectionné le mode d&#39;analyse d&#39;un fichier individuel de l&#39;exécution, l&#39;instrument groupe automatiquement les échantillons positifs et négatifs. Avant de génotypage chaque sous-ensemble, l&#39;utilisateur peut modifier manuellement les appels. <ol><li> De la fusion soitcourbe ou pic de fusion de vue, cliquez-droit sur les courbes d&#39;être retiré pour les sélectionner. Après avoir sélectionné les échantillons mal classés, aller à la &quot;Nouvel appel&quot;, sélectionnez le regroupement approprié, puis cliquez sur &quot;Appliquer les modifications.&quot; </li></ol></li></ol></li><li> Normaliser <ol><li> De la dérivée négative de fluorescence normalisée par rapport à la température (-dF / dT) («Courbes de différence») vue, déplacer les barres de normalisation pour entourer la sonde fondre région. Remarque: La sonde fondre région est inférieure à la température des deux zones de fusion. Les barres de normalisation doivent être à la base des pics de fusion. </li></ol></li><li> Calculer les groupes <ol><li> Après la normalisation, sélectionnez «groupes Calculer» pour assigner automatiquement des échantillons à des groupes. Si nécessaire, des échantillons-Assign re manuellement à des groupes spécifiques. Remarque: Certains logiciels d&#39;analyse a des seuils élevés de sensibilité qui ne peuvent pas être modifiés; dans ces cas, la software pourrait assigner des échantillons à différents groupes qui appartiennent visuellement à l&#39;autre. </li></ol></li><li> Attribuer génotypes <ol><li> Attribuer génotypes pour chaque groupe basé sur les normes (contrôles positifs). <ol><li> Après que l&#39;utilisateur confirme que les groupes calculés se sont correctes (sinon, que les modifications appropriées ont été apportées sous l&#39;onglet Regroupement en sélectionnant des échantillons mal classés et en sélectionnant le groupe de droite de la boîte de dépôt à côté de &quot;Nouvel appel&quot;), sélectionnez &quot;Modifier les noms de groupes &quot;sous l&#39;onglet&quot; Regroupement &quot;. </li><li> Entrez les génotypes des normes dans le cadre de couleur correspondant (par exemple, si 3d7 standard a un connu un génotype et est dans le groupe rouge, le groupe rouge a génotype A). Appuyez sur &quot;OK&quot; et enregistrer les résultats. </li></ol></li></ol></li><li> Exporter les résultats <ol><li> Exporter génotype appelle comme un tableur pour une analyse plus approfondie de la population de l&#39;échantillon. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. 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T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Continu GRH est une étape d&#39;analyse post-PCR; par conséquent, l&#39;échantillon et de la configuration de test est similaire à des protocoles de PCR standard, avec l&#39;incorporation supplémentaire d&#39;un colorant fluorescent intercalant utilisé pour suivre le passage de la double-brin de l&#39;ADN simple brin pendant l&#39;étape de fusion de haute résolution. Le facteur le plus important pour l&#39;analyse de la GRH réussie est un produit de PCR robuste. Essai conception est la clé, et plusieurs outils optimisés pour la conception de l&#39;essai de la GRH sont disponibles dans le commerce et en ligne 13. Longueurs de amplicon de 80-150 paires de bases avec accompagnement ~ 20 paires de base bloqués sondes centrée sur le SNP ou SNP de travail de l&#39;intérêt supérieur de différencier SNP ainsi que haplotypes de multiples SNP dans la région de la sonde. Les sondes peuvent être bloquées en utilisant soit une terminaison 3 &#39;C3 espaceur ou une paire mésappariement de base 2 à l&#39;extrémité 3&#39;, qui empêchent l&#39;extension au cours de l&#39;amplification. Les sondes peuvent être conçus pour correspondre le brin Watson Crick ou modèle; le choixdépend de tests empiriques pour déterminer qui sonde la conception produit des pics de fusion acceptables. Excédent avant ou arrière amorces sont utilisées pour produire des produits d&#39;amplification simple brin qui apparie les sondes bloqués. Si la sonde contient la séquence du brin avant, puis amorce inverse est utilisé en excès, généralement dans un rapport de 1: 5, et vice-versa pour les sondes qui correspondent le brin inverse. De même, la GRH fonctionne mieux avec produit de PCR suffisante et robuste. PCR optimisation de la réaction nécessite des gels de gradient de PCR et agarose ou analyse Bioanalyzer pour déterminer les températures de recuit optimales. Modèle de concentration peut être augmentée en utilisant des procédés tels que la pré-amplification, amplification multiplexée biaisée de toutes les cibles à l&#39;aide de la concentration de l&#39;amorce et à faible nombre de cycles d&#39;augmenter la concentration de matrice 13. Seule une poignée d&#39;instruments sont compatibles avec MAAB. Les propriétés thermiques des tubes capillaires de verre i utilisésn ces systèmes facilitent cette méthode. Le petit diamètre intérieur des capillaires ainsi que le transfert rapide de la chaleur à travers le verre offrent un contrôle de température plus rigoureuses que plasticware PCR standard, qui a plus lents taux de transition entre les cycles de recuit et de dénaturation en raison des propriétés d&#39;isolation thermique des matières plastiques. Avec cette méthode, la sensibilité de détection peut être réduite de 2 à 5% à moins de 1% d&#39;un allèle mutant dans un mélange de type sauvage et mutantes 10 allèles. GRH est un outil facile, efficace et économique pour génotypage des SNP dans une variété de paramètres et de nombreuses applications, la surveillance des maladies infectieuses à la numérisation pour les variantes de gènes du cancer. Plusieurs autres instruments, comme la Roche Nano et systèmes LightCycler (480 et 96) ainsi que l&#39;Eco en temps réel offre système PCR GRH, en plus de l&#39;amplification standard, en temps réel, et la fonctionnalité du nombre de copies. Utilisant des machines plus débit, GRH codes-barres coûte less à 0,50 $ par test dans nos mains, y compris tous les réactifs et consommables. Dans le contexte décrit ici, les applications sur le terrain permettent la surveillance de la population en temps réel pour des changements associés aux efforts de lutte contre le paludisme, y compris réduction de la diversité de la population, la détection de types de parasites importés, et l&#39;apparition et la propagation de SNPs associés à la sensibilité de la drogue réduite. Améliorations à la méthode offrent une sensibilité supplémentaire utile pour informer les progrès vers l&#39;élimination du paludisme et de l&#39;éradication.

Malgré un regain d&#39;intérêt dans le contrôle du paludisme et de l&#39;éradication, le paludisme demeure un fardeau dans le monde, avec près de la moitié de la population mondiale au risque d&#39;infection et plus de 550.000 décès par an, en particulier les enfants en Afrique sub-saharienne 1. Ces nouveaux programmes de lutte et d&#39;éradication ont été soutenus par la renaissance génomique, avec un grand nombre de parasites du paludisme séquencé et analysé des mutations associées à une sensibilité réduite de drogue, une virulence accrue, et pour les caractéristiques de la population 2,3. Polymorphismes d&#39;un seul nucléotide (SNP) sont parmi les variantes génétiques les plus couramment identifiés 4-7. Méthodes de génotypage SNP portables offrent sur ​​place et la surveillance de la population en temps réel et de suivi 8. En plus d&#39;empreintes digitales individuelles parasites, le «code à barres moléculaire» est également utilisé pour détecter des décalages temporels spectaculaires de fréquence alléliqueainsi que la variance taille effective de la population et de la complexité de l&#39;infection 9. Bien que cet ensemble de informative SNP est facilement adaptable à de nombreuses plateformes de génotypage à haute résolution fusion (GRH) analyse est particulièrement bien adapté à sur le terrain des études, où le fonctionnement et la détection de nouvelles mutations à faible coût sensible et simple par rapport au séquençage et d&#39;autres les approches sont attrayants dans les milieux pauvres en ressources. HRM commence par réaction en chaîne par polymérase standard (PCR) qui incorpore un colorant fluorescent. Post-PCR analyse fusion détermine la température maximale amplicon de fusion; une seule différence SNP dans un court amplicon peut entraîner une importante température pic de fusion (Tm) des différences. Plusieurs améliorations apportées à cette méthode offrent une meilleure résolution pour différencier génotypage SNP y compris la classe IV (AT) SNP, et de détecter les allèles mutants mineures dans les échantillons avec de multiples allèles présents (polyGinfections enomic). Tout d&#39;abord, les tests incluent des sondes courtes centrés sur la région SNP en plus des amorces sens et antisens qui sont présents à des concentrations différentes. Ces sondes ne sont pas bloqués pendant la PCR amplifiés, mais se lient au brin produite au-delà du fait de concentrations d&#39;amorces asymétriques qui augmentent la production du produit sonde-modèle. Ces amplicons double brin distincts constitués de sonde liée à l&#39;excès de brin matrice sont ~ 20-30 pb; leur diminution significative longueur par rapport à l&#39;ensemble du amplicon (80-150 pb) conduisent à des différences beaucoup plus importantes Tm associés à une base unique ou multiple sonde modèle mal assortit 10. Deuxièmement, le biais de l&#39;amplification de l&#39;allèle mutant (MAAB) abaisse la température de recuit de réaction pour solliciter la réaction vers alleles mutants présents à de faibles taux dans les infections polygenomic. La température de recuit est fixé entre les Tm de (type sauvage) parfaitement adapté et dépareillés sonde (mutant)s. A cette température, la fixation de l&#39;allèle de type sauvage est suffisamment stable que l&#39;amplification est entravée par rapport à son équivalent de décalage, sollicitant ainsi l&#39;amplification vers l&#39;allèle mutant lorsque les deux sont présents dans un seul échantillon de 10. Avec ces améliorations en matière de GRH, cette technologie a permis le suivi des origines et de l&#39;identité des parasites associés à des infections épidémiques en Amérique du Sud 11 et la détection de nouvelles mutations, la différenciation de plusieurs SNP situés juste à côté de l&#39;autre dans l&#39;ordre, et les mutations présentes dans moins de 1 % des alleles dans les échantillons polygenomic 10. Augmentation de la sensibilité est particulièrement important dans les régions qui approchent le statut de pré-élimination et ceux à risque de résistance aux médicaments émergents. La capacité d&#39;identifier rapidement et facilement les parasites et les SNP importés associés à la sensibilité réduite sur site informe les efforts de surveillance et des programmes de contrôle au sujet del&#39;efficacité de leur mise en œuvre et identifie les points chauds pour l&#39;augmentation éradication du paludisme et d&#39;élimination efforts. Ce protocole décrit les méthodes de sonde bloquée repose-et MAAB pour une sensibilité accrue GRH de génotypage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Malgré des décennies d&#39;efforts d&#39;éradication, le paludisme demeure un fardeau mondial. Un regain d&#39;intérêt récent dans l&#39;élimination régionale et l&#39;éradication mondiale a été accompagnée par une augmentation de l&#39;information génomique sur les espèces parasite Plasmodium responsables du paludisme, y compris les caractéristiques des populations géographiques ainsi que les variations associées à une sensibilité réduite aux médicaments anti-paludéens. Une variation génétique commune, polymorphismes d&#39;un seul nucléotide (SNP), offre des cibles attrayantes pour génotypage du parasite. Ces marqueurs sont utiles non seulement pour le suivi des marqueurs de résistance aux médicaments, mais aussi pour le suivi des populations de parasites en utilisant des marqueurs ne relevant pas de la drogue ou d&#39;autres pressions sélectives. Méthodes de génotypage SNP offrent la possibilité de suivre la résistance aux médicaments ainsi que relever les empreintes digitales des parasites individuels pour la surveillance de la population, en particulier en réponse aux efforts de lutte contre le paludisme dans les régions en voie d&#39;éliminal&#39;état ionique. Alors que SNP informatifs ont été identifiés qui sont agnostiques aux technologies de génotypage spécifiques, à haute résolution de fusion (GRH) analyse est particulièrement adapté études basées champ à. Comparé aux méthodes standards fluorescente-Probe qui nécessitent SNP individuels dans une sonde marquée seule et offrent, au mieux, 10% de sensibilité pour détecter les SNP dans les échantillons qui contiennent plusieurs génomes (polygenomic), GRH propose 2-5% de sensibilité. Modifications à la GRH, tels que des sondes bloqués et les concentrations d&#39;amorces asymétriques ainsi que l&#39;optimisation de l&#39;amplification des températures de recuit biais PCR vers l&#39;amplification de l&#39;allèle mineur, augmentent encore la sensibilité de la GRH. Bien que l&#39;amélioration de la sensibilité dépend de la dosage spécifique, nous avons augmenté la sensibilité de détection à moins de 1% de l&#39;allèle minoritaire. Dans les régions qui approchent l&#39;éradication du paludisme, la détection précoce de l&#39;émergence ou la résistance aux médicaments importés est essentiel pour prOmpT réponse. De même, la capacité de détecter et de différencier les infections polygenomic types de parasites importés de réservoirs locaux cryptiques peut informer les programmes de contrôle. Ce manuscrit décrit les modifications à la technologie de fusion haute résolution qui augmentent encore sa sensibilité pour identifier les infections polygenomic dans les échantillons de patients.

Les données peuvent être visualisées de plusieurs manières différentes, en fonction du logiciel d&#39;analyse et l&#39;instrument. Typiquement, un tracé de la dérivée négative de la fluorescence normalisée par rapport à la température (-dF / dT) par rapport aux résultats de la température est la plus simple pour la visualisation de pics de fusion et de déterminer les génotypes. Une fenêtre de fusion complète (40 ° C-80 ° C) se traduira par deux régions d&#39;amplicon et de la sonde fusion. La figure 1 montre un exemple de pics de fusion normalisées pour les deux régions. Réglage de la fenêtre d&#39;analyse aux seuls résultats de la région de la sonde dans la différenciation claire des pics correspondant aux SNP spécifiques (Figure 2). Analyse basée sur une sonde montre clairement la présence de deux allèles que des pics individuels avec des températures de fusion qui correspondent à des pics SNP homozygotes (figure 3). La figure 4 montre que progressiréduire vement la température de recuit au cours de l&#39;amplification (Maab) se traduit par une préférence pour l&#39;allèle mutant (pic de gauche) (figure 4A), ce qui entraîne une sensibilité accrue pour l&#39;allèle mutant dans une population d&#39;allèles mixtes (figure 4B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figure 1. régions de sonde et amplicon fusion. Traçant la dérivée négative de la fluorescence normalisée par rapport à la température sur une large fenêtre de résultats de fusion à la fois la sonde (température inférieure) et des pics amplicon de fusion qui peuvent être analysés. (Adapté de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 2. Probe pics de fusion. Les matchs parfaits (typiquement des allèles sauvages) entraîner des pics de fusion plus élevés (en rouge), tandis que l&#39;inadéquation SNP ont des températures plus basses de fusion (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figure 3. Polygenomic pics de fusion. Lorsque les deux allèles sont présents dans un échantillon, l&#39;analyse de la gestion des ressources humaines basée sonde représente les deux allèles que les courbes de deux pics (orange) avec des pics qui correspondent à des échantillons individuels d&#39;un allèle (rouge et gris). (Adapté de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande v</a>ersion de ce chiffre. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figure 4. allèle mutant amplification biais (MAAB). A. Abaisser progressivement la température de recuit amplification biais de la réaction de pic de fusion vers pic correspondant à l&#39;allèle mutant (température plus basse) dans un échantillon ou polygenomic polyallélique. B. MAAB résulte de la sensibilité de la GRH pour détecter les allèles mineurs présents à moins de 1% dans les échantillons polygenomic ou polyallélique. (Partie B adapté de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Tableau 1. Set-up de haute résolution des réactions de fusion d&#39;amplification basés sur la sonde. <table><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume par rel&#39;action (plaque de 96 puits et un tube capillaire) </td><td> Volume par réaction (384 puits plaque) </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> GRH Master Mix </td><td> 4-5 pi </td><td> 2-2,5 ul </td><td> 1 fois </td></tr><tr><td> 10 x amorce en excès </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,50 uM </td></tr><tr><td> 10 x autre amorce </td><td> 1 ul </td><td> 0.5μl </td><td> 0,1 pM </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,40 uM </td></tr><tr><td> L&#39;eau qualité PCR </td><td> 1-2 pi </td><td> 0,5-1 ul </td><td></td></tr><tr><td> Patron de l&#39;ADN </td><td> 1 ul </td><td> 0,5 ul </td><td> De 0,01 à 10 ng / ul </td></tr><tr><td></td><td> 10 ul </td><td> 5 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. StandarD haute résolution conditions fusion d&#39;amplification. <table><tbody><tr><td> Température </td><td> Temps </td></tr><tr><td> Tenir </td><td> 95 ° C </td><td> 120 s </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 cycles </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 cycle </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sec </td></tr></tbody></table> * Cette température est amplicon-dépendante Tableau 3. Conditions amplification pour mutant biais allèle d&#39;amplification. <table><tbody><tr><td> Température </td><td> Temps </td><td> Cycles </td><td> Taux de rampe </td><td> Mode d&#39;acquisition </td><td> Mode d&#39;analyse </td></tr><tr><td> Dénaturer </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Aucun </td&gt; <td> Aucun </td></tr><tr><td rowspan="2"> Cycle </td><td> 95 ° C </td><td> 2 s </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Aucun </td><td rowspan="2"> Quantification </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sec </td><td> 20 </td><td> Unique </td></tr><tr><td rowspan="3"> Faire fondre </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sec </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0,3 </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sec </td><td rowspan="2"> Continu </td><td rowspan="2"> Faire fondre </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sec </td></tr></tbody></table> * Cette température est amplicon-dépendante et sera réduite lors de l&#39;exécution MAAB

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Bien que l&#39;analyse haute résolution de fusion offre la possibilité de différencier les polymorphismes nucléotidiques simples dans une population hétérogène, biais d&#39;amplification allèle mutant peut augmenter sa capacité à détecter les allèles présents à des pourcentages relativement faibles dans un échantillon. Ce protocole décrit des améliorations qui permettent d&#39;améliorer la sensibilité de l&#39;analyse de fusion de haute résolution.

Méthodes pour augmenter la sensibilité de la haute résolution de fusion Single Nucleotide Polymorphism génotypage dans le paludisme

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