Name: methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Forfatterne takker Bill og Melinda Gates Foundation for sin støtte til teknologiutvikling og opplæring.

Merk: Denne protokollen omfatter volumer og konsentrasjoner for 96-brønns plate, 8-tube strimler, og kapillær-baserte systemer (10 pl reaksjonsvolum); kan imidlertid HRM også bli utført i 384-brønn plate-baserte systemer med en 5 pl reaksjonsvolum ved å skalere alle volumer tilsvarende. Utvalget av gjenkjenning for de fleste systemer er 10 pg 10 ng mal DNA. 1. Forbered Maler <ol><li> Oppnå Plasmodium falciparum prøver direkte fra blod oppnådd fra pasienter som deltar i feltstudier språk og lagret som fullblod, pelleterte røde blodceller, eller på filterpapir. Merk: Prøver kan også være kultur innrettet til å vokse in vitro; noen standard laboratoriestammer for analyse kan bestilles fra Malaria Research and Reference Reagens Resource Center (MR4, kan prøvene brukes direkte fra pelleterte røde blodceller eller kultur eller hentet fra fullblod, røde blodceller, eller filterpapir. </li><li> DNA ekstrahert frafilterpapir eller kulturtilpasset stammer Merk: HRM er følsom for saltkonsentrasjon; konsentrasjons forskjeller på grunn av variable utvinningsmetoder kan påvirke smeltetemperaturer. Selv om spesielle endelige buffere ikke er en betydelig faktor for suksess ved å bruke en standard felles eluering eller resuspendering buffer (dvs. vann, 1x Te [&quot;lav Te&quot; eller &quot;DNA suspensjon buffer &#39;: 10 mM Tris-Cl, 0,10 mM EDTA], eller 1x TE [10 mM Tris-CI, 1 mM EDTA]) for alle prøver å unngå avvikende eller inkonsistente smeltekurver. <ol><li> Forbered mal fortynninger av 10 pg -10 ng per mL i standard Te, TE, eller vann for hver 10 mL reaksjon. </li></ol></li><li> Direkte forsterkning fra pelleterte røde blodceller <ol><li> Bestem parasitemia av røde blodceller ved hjelp av tynn-mikroskopi Merk: Metoder for å bestemme parasitemia av infiserte røde blodcellene er tilgjengelig fra Centers for Disease Control and Prevention (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Fortynne parasitemias over 0,5% 1: 400 i PCR-grade vann, TE, eller Te. Bruke 3 mL for hver 5- 10 mL reaksjon. </li></ol></li><li> Kontroller Merk: HRM kan brukes til skanning for å påvise genet sekvensvarianter i en populasjon 12; krever imidlertid nøyaktig genotyping standarder sekvens bekreftet å inneholde SNP blir avhørt. Plasmidkonstruksjoner eller malaria isolater med kjente genotyper kan benyttes. For de fleste applikasjoner, er 3D7 (MR4 MRA-151) brukes som en vill-type kontroll. På grunn av mellom-run variasjon, alltid inkludere positive og negative kontroller. <ol><li> Positive kontroller: Forbered 10 pg - 10 ng per 1 mL fortynninger av plasmid eller standarder med sekvens verifisert SNP genotyper. </li><li> Negativ kontroll: Bruk PCR grade vann som en no-mal kontroll (NTC) for amplifikasjonsreaksjonene. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR Amplification <ol><li> Forbered reaksjonsblandingen <ol><li> (Valgfritt) Mineralolje overlegg. Merk: Noen HRM systemer er frittstående smelte plattformer og ikke har et oppvarmet lokk for å unngå kondens og produkt fordampning under forsterkning. <ol><li> Tilsett 20 pl lett mineralolje til hver brønn plate før lasting av reaksjonsblandingen. </li></ol></li><li> Forbered 10x arbeider bestander av alle analyser <ol><li> Se tabell 1 for anbefalte 10x arbeider aksje konsentrasjoner samt sluttkonsentrasjoner for blokkert-probe-baserte HRM genotyping. </li></ol></li><li> Forbered Reaksjonsblandingene <ol><li> Til hver brønn i plate eller tube, tilsett 1 mL 10x jobbe lager forover og bakover primere og prober, 4,0 til 5,0 mL 2.5x eller 2.0x HRM mester mix, 1 ul mal, og PCR grade vann for totalt reaksjonsvolum på 10 ul . </li></ol></li><li> Bånd eller rør <ol><li> Bruke optisk plate seals for platebasert forsterkning, optiske landskamper for strip-tube-baserte systemer, og plasthetter for kapillær-baserte systemer. Pass på at dekningen er komplett og plater og caps er helt forseglet og sikret for å hindre fordamping under forsterkning. </li></ol></li><li> Spin prøver <ol><li> Ringplatene 3 min ved 1800 x g for å fjerne luftbobler og for å separere olje- og vannfasene hvis mineralolje benyttes. </li></ol></li></ol></li><li> Amplifikasjonsprotokoll <ol><li> Plasser reaksjons plater eller rør i termosykler. Kjøre standard blokkert-sonde eller MAAB forsterker protokoller (tabell 2 og 3, henholdsvis). Legg merke til forskjellen i glødetemperaturen mellom disse metodene. </li></ol></li></ol> 3. HRM Analyse <ol><li> Smelte <ol><li> Etter PCR forsterkning, fortsett til smelting analyse. For frittstående smelting systemer som ikke har innebygd forsterkning (f.eks., BioFire Forsvars LightScanner systemer), reflytte forsterket plate fra termosykler og plasser i HRM instrument. Fra systemet programvare-grensesnitt, smelte plate fra 40 - 80 ° C for å fremstille både probe og amplikon smeltetopper. Merk: For å spare smelting og analyse tid, kan smelte vinduet forkortes å dekke temperaturområder for bare sondere eller amplicon smelte regioner. Etter smelting, plater og rør kan smeltes om nødvendig og lagret ved -20 ° C eller 4 ° C. Lagres glassrør bare ved 4 ° C for å hindre rørene fra cracking. </li></ol></li><li> Smelt analyse <ol><li> Fjern negative prøver <ol><li> Innenfor analyseprogramvare, fjern fra videre analyse prøver som ikke forsterker eller som får hakkete smeltetopper. Merk: Når du har valgt modusen for analyse for en privatperson kjøre filen, instrumentets automatisk grupper de positive og negative prøver. Før genotyping hver undergruppe, kan brukeren manuelt endre samtalene. <ol><li> Enten fra smeltekurve eller smeltetopp visning, høyreklikk på kurvene som skal fjernes for å velge dem. Når du har valgt misklassifisert prøvene, gå til &quot;New Call&quot;, velg riktig gruppering, og klikk &quot;Apply Change&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Normal <ol><li> Fra den negative derivat av normalisert fluorescens med hensyn til temperatur (Df / dT) (&#39;Forskjellen Kurver&#39;) visning, flytte normaliserings barer å omgi sonden smelte regionen. Merk: Sonden smelteområdet er den lavere temperatur av de to smelte regionene. Normaliserings stolpene skal være på undersiden av smeltetopper. </li></ol></li><li> Beregn grupper <ol><li> Etter normalisering, velger &#39;Beregn grupper &quot;for å automatisk tildele prøver til grupper. Om nødvendig, nytt manuelt tildele prøver til bestemte grupper. Merk: Noen analyse programvare har høy sensitivitet terskler som ikke kan endres; i disse tilfeller, software kan tildele prøver til ulike grupper som visuelt tilhører en annen. </li></ol></li><li> Tildele genotyper <ol><li> Tildele genotyper for hver gruppe basert på standarder (positive kontroller). <ol><li> Etter at brukeren bekrefter at de beregnede grupper er korrekt (hvis ikke, har den riktige endringene blitt gjort under fanen Gruppering ved å velge misklassifisert prøver og velge riktig gruppe fra drop-boksen ved siden av &quot;Ny samtale&quot;), velg &quot;Rediger gruppe Navn &quot;under&quot; Gruppering &quot;-kategorien. </li><li> Angi genotypene av standardene i det tilsvarende fargede boksen (for eksempel hvis standard 3d7 har en kjent A genotype, og er i red-gruppen, har de røde gruppen genotype A). Trykk &quot;OK&quot; og lagre resultatene. </li></ol></li></ol></li><li> Eksporter resultater <ol><li> Eksporter genotype samtaler som et regneark for videre analyse lysegenskaper. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Kontinuerlig HRM er et post-PCR-analyse trinn; Derfor, er prøven og analyseoppsett lik standard PCR protokoller, med den ytterligere innlemmelse av et fluorescerende fargestoff interkalerende brukes til å følge overgangen fra dobbelt-trådet til enkelttrådet DNA i løpet av høyoppløselige smeltetrinn. Den viktigste faktoren for vellykket HRM analyse er en robust PCR produkt. Analysen design er nøkkelen, og flere verktøy optimalisert for HRM analysen designen er tilgjengelig kommersielt og online 13. Amplicon lengder på 80-150 basepar med tilhørende ~ 20 basepar blokkert sonder sentrert over SNP eller SNPs av interesse arbeid best å skille SNPs samt haplotyper av flere SNPs i sonden regionen. Prober kan bli blokkert ved hjelp av enten en 3 &#39;C3 spacer eller en to basepar mistilpasning i 3&#39;-enden, som hindrer forlengelse i løpet av amplifisering. Prober kan være utformet for å matche Watson eller Crick templatkjeden; Valgetavhenger empirisk testing for å avgjøre hvilken probe design gir akseptable smeltetopper. Overskytende fremover eller bakover primere blir brukt til å produsere enkelt-trådet amplifikasjonsprodukt som hybridiserer til de blokkerte sonder. Dersom proben inneholder den fremre trådsekvens, og deretter revers primer anvendes i overskudd, vanligvis i et 1: 5-forhold, og vice-versa for prober som svarer til den motsatte tråden. Tilsvarende fungerer HRM best med tilstrekkelig og robust PCR produkt. PCR reaksjon optimalisering krever gradient PCR og agarosegeler eller Bioanalyzer analyse for å fastslå optimale annealing temperaturer. Mal-konsentrasjonen kan økes ved anvendelse av metoder så som forhåndsforsterkning, forspent multiplekset amplifikasjon av alle mål ved bruk av lavt primer konsentrasjon og syklus tall for å øke konsentrasjonen 13 av malen. Bare en håndfull av instrumenter er kompatible med MAAB. De termiske egenskapene til glasskapillærer rør brukt in disse systemene lette denne metoden. Den lille indre diameter av kapillærene, samt rask varmeoverføring gjennom glass har strengere temperaturkontroll enn standard PCR plasticware, som har lavere overgangshastigheter mellom varmebehandlingssykluser og denaturering på grunn av de termiske isolerende egenskaper av plast. Med denne metoden kan deteksjonsfølsomheter reduseres fra 2-5% til mindre enn 1% av et mutant allel i en blanding av villtype og mutante alleler 10. HRM er en lettvint, effektiv og økonomisk verktøy for SNP genotyping i en rekke innstillinger og en rekke bruksområder, fra infeksjonssykdom overvåking til scanning for kreft genvarianter. Flere andre instrumenter, som for eksempel Roche Nano og LightCycler systemer (480 og 96) samt Eco Real-time PCR system tilbudet HRM i tillegg til standard forsterkning, real-time, og copy-nummer funksjonalitet. Ved hjelp av høyere throughput maskiner, koster HRM barcoding less enn $ 0,50 per analysen i våre hender, inkludert alle reagenser og forbruksvarer. I forbindelse som er beskrevet her, feltbaserte applikasjoner tillate sanntidsovervåkning populasjonen for endringer forbundet med malaria kontroll innsats, inkludert redusert populasjon mangfold påvisning av importerte parasitt typene, og utseendet og spredning av SNP&#39;er assosiert med redusert medikamentsensitivitet. Forbedringer til metoden gir ekstra følsomhet nyttig for å informere fremgang mot malaria eliminering og utrydding.

Til tross for fornyet interesse for malaria kontroll og utrydding, forblir malaria en verdensomspennende byrde, med nesten halvparten av verdens befolkning står i fare for infeksjon og mer enn 550.000 dødsfall årlig, spesielt barn i Afrika sør for Sahara en. Disse nye bekjempe og utrydde programmer har blitt støttet av genomisk renessanse, med et stort antall malariaparasitter sekvensert og analysert for mutasjoner assosiert med redusert narkotika følsomhet, økt virulens, og for befolknings egenskaper 2,3. Single-nukleotid polymorfismer (SNPs) er blant de hyppigst identifiserte genetiske varianter 4-7. Bærbare SNP genotyping metodene tilbyr på stedet og real-time befolkningen overvåking og sporing 8. I tillegg til å fingerprinting individuelle parasitter, er den &quot;molekylære strekkoden &#39;også brukes til å detektere dramatiske temporale endringer i frekvens allelsamt variansen effektiv populasjonsstørrelse og kompleksitet infeksjon 9. Mens dette settet av informative SNPs enkelt tilpasses mange genotyping plattformer, høy oppløsning smelter (HRM) Analysen er spesielt godt egnet til feltbaserte studier, hvor sensitive og enkel betjening og påvisning av nye mutasjoner til lave kostnader i forhold til sekvensering og andre tilnærminger er attraktive i ressursfattige innstillinger. HRM starter med standard polymerase kjedereaksjon (PCR) som inneholder et fluorescerende fargestoff. Post-PCR smelter analyse bestemmer peak amplicon smeltetemperatur; en enkelt SNP forskjell i en kort amplikon kan resultere i betydelig spiss-smelte-temperatur (Tm) forskjeller. Flere forbedringer til denne metoden bedre genotyping vedtak om å skille SNPs inkludert klasse IV (AT) SNPs, og oppdage mindre mutante alleler i prøver med flere alleler stede (polygenomic infeksjoner). Først analysene innlemme korte prober sentrert over SNP-regionen i tillegg til forover og revers primere som er til stede ved forskjellige konsentrasjoner. Disse blokkerte prober ikke er forsterket ved PCR, men binder seg til strengen som produseres i overskudd på grunn av asymmetriske primer konsentrasjoner som øker produksjonen av sonde-mal produkt. Disse separate dobbelt-trådede amplikonene som består av probe bundet til det overskytende templatkjeden er ~ 20 til 30 bp; deres betydelig redusert lengde i forhold til hele amplikonet (80-150 bp) føre til mye større Tm forskjeller knyttet til én eller flere basis probe-malen ikke samsvarer med 10. For det andre mutant allel forsterkning skjevhet (MAAB) senker reaksjonsglødetemperaturen for å forspenne reaksjonen mot mutante alleler til stede ved lave forhold i polygenomic infeksjoner. Glødetemperaturen ligger mellom de Tms med perfekt matchet (villtype) og feilaktige (mutant) probes. Ved denne temperaturen, binding av villtype-allelet er stabil nok til at amplifikasjon blir hindret i forhold til sin mismatch tilsvarende, og dermed forspenne forsterkning mot mutant allel når begge er til stede i en enkelt prøve 10. Med disse HRM forbedringer, har denne teknologi tillot sporing av opprinnelse og identiteten av parasitter i forbindelse med epidemiske infeksjoner i Sør-Amerika 11 og påvisning av nye mutasjoner, differensiering av flere SNP som ligger umiddelbart ved siden av hverandre i sekvens, og mutasjoner til stede i mindre enn ett % av allelene i polygenomic prøvene 10. Økt følsomhet er spesielt viktig i områdene nærmer pre-eliminering status og de med risiko for nye medikamentresistens. Evnen til å raskt og enkelt identifisere importerte parasitter og SNPs assosiert med redusert følsomhet på stedet opplyser overvåkingsarbeidet og kontrollprogrammer omeffektiviteten av sine implementeringer og identifiserer hotspots for økt malaria utrydding og eliminering innsats. Denne protokollen beskriver metoder for blokkert-probe-basert og MAAB for økt HRM genotyping følsomhet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Til tross for flere tiår med utrydding innsats, forblir malaria en global byrde. Nylige fornyet interesse for regional eliminering og global utrydding har vært ledsaget av økt genomisk informasjon om plasmodiumparasitten arter som er ansvarlige for malaria, inkludert egenskapene til geografiske populasjoner samt variasjoner forbundet med redusert følsomhet overfor anti-malaria medisiner. En vanlig genetisk variasjon, single-nukleotid polymorfismer (SNPs), tilbyr attraktive mål for parasitten genotyping. Disse markørene er nyttig ikke bare for å spore narkotika resistensmarkører, men også for sporing parasitt populasjoner bruker markører som ikke er under narkotika eller andre selektive press. SNP genotyping metodene tilbyr muligheten til å spore narkotika motstand samt å fingeravtrykk enkelte parasitter for overvåking befolkningen, spesielt i respons til malaria kontroll innsats i områder nærmer elimination status. Mens informative SNPs har blitt identifisert som er agnostiker til bestemte genotyping teknologier, er høy oppløsning smelter (HRM) analyse spesielt egnet til felt-baserte studier. Sammenlignet med standard fluorescerende-probe baserte metoder som krever individuelle SNPs i en enkelt merket probe og tilbyr i beste fall 10% sensitivitet for å oppdage SNPs i prøver som inneholder flere genomer (polygenomic), HRM tilbyr 2-5% sensitivitet. Modifikasjoner til HRM, for eksempel blokkerte prober og asymmetriske primer konsentrasjoner, så vel som optimalisering av forsterkning annealing temperaturer for å forspenne mot PCR-amplifikasjon av det mindre allelet, ytterligere øke sensitiviteten av HRM. Mens følsomheten forbedring avhenger av den spesifikke analyse, har vi økt deteksjonsfølsomheter til mindre enn 1% av det mindre allel. I regioner nærmer malaria utrydding, er avgjørende for pr tidlig påvisning av nye eller importert narkotika motstandompT respons. Likeledes, kan evnen til å oppdage polygenomic infeksjoner og differensiere importerte parasitt typer fra kryptiske lokale reservoarer informerer kontrollprogrammer. Dette manuskriptet beskriver modifikasjoner høy oppløsning smelte teknologi som øker følsomheten for å identifisere polygenomic infeksjoner i pasientprøver.

Data kan bli visualisert på flere forskjellige måter, avhengig av analyseprogrammet og instrument. Vanligvis er en plott av den negative deriverte av fluorescens normalisert med hensyn til temperatur (Df / dT) mot temperatur resulterer enkleste for å visualisere smeltetopper og bestemmelse genotyper. En full smelting vindu (40 ° C-80 ° C) vil føre til at begge amplikonet og probe smelting regioner. Figur 1 viser et eksempel på normaliserte smeltetopper på begge regioner. Innstilling av analysevinduet til bare proberegionen resulterer i klare differensiering av topper tilsvarende spesifikke SNP&#39;er (figur 2). Probe basert analyse viser tydelig tilstedeværelse av begge alleler som individuelle topper med smeltetemperaturer som svarer homozygot SNP topper (figur 3). Figur 4 viser at progressivt redusere glødetemperaturen i løpet av forsterkning (MAAB) resulterer i en skjevhet mot mutant allel (venstre side peak) (figur 4A), noe som resulterer i økt følsomhet for det mutante allel i en populasjon av blandede alleler (figur 4B). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figur 1. Probe og amplikon smelte regioner. Plotte negative deriverte av den normaliserte fluorescens med hensyn til temperatur over et bredt smeltevindus resulterer både probe (lavere temperatur) og fragment smeltetopper som kan analyseres. (Hentet fra Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Figur 2. Probe smelte topper. Perfekt kampene (typisk villtype alleler) resultere i høyere smelte topper (rød), mens SNP uoverensstemmelser har lavere smeltetemperatur (grå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figur 3. Polygenomic med smeltetopper. Når begge alleler er tilstede i en prøve, representerer probe-baserte HRM analyse begge alleler som to-peak kurver (orange) med topper som svarer til enkelt-allelet prøver (røde og grå). (Hentet fra Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se et større v</a>ersjon av dette tallet. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figur 4. Mutant allel forsterkning skjevhet (MAAB). A. Progressivt å senke forsterkningen glødetemperaturen forspenner smeltetopp reaksjonen mot topp tilsvarende det mutant (lavere temperatur) allel i en polygenomic eller polyallelic prøven. B. MAAB resulterer i HRM sensitivitet for å påvise mindre alleler stede på mindre enn 1% i polygenomic eller polyallelic prøver. (Del B tilpasset fra Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Tabell 1. Set-up av probe-baserte høyoppløste smelte amplifikasjonsreaksjoner. <table><tbody><tr><td> Komponent </td><td> Volum per rehandling (96-brønns plate og kapillarrør) </td><td> Volum per reaksjon (384-brønners plate) </td><td> Endelig konsentrasjon </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4-5 pl </td><td> 2-2,5 ul </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x Overflødig primer </td><td> 1 mL </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,50 mikrometer </td></tr><tr><td> 10 x Andre primer </td><td> 1 mL </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,1 mikrometer </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 mL </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,40 mikrometer </td></tr><tr><td> PCR-grade vann </td><td> 1-2 pl </td><td> 0,5-1 mL </td><td></td></tr><tr><td> Mal DNA </td><td> 1 mL </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,01-10 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> 10 mL </td><td> 5 pl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 2. Standard høyoppløselige smelte amplifikasjonsbetingelser. <table><tbody><tr><td> Temperatur </td><td> Tid </td></tr><tr><td> Holde </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sek </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 sykluser </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td rowspan="2"> En syklus </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sek </td></tr></tbody></table> * Denne temperatur er fragment avhengig Tabell 3. Forsterkning vilkår for mutant allel forsterkning bias. <table><tbody><tr><td> Temperatur </td><td> Tid </td><td> Cycles </td><td> Ramp rente </td><td> Oppfangningsmodus </td><td> Analyse modus </td></tr><tr><td> Denaturering </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> None </td&gt; <td> None </td></tr><tr><td rowspan="2"> Syklus </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sek </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> None </td><td rowspan="2"> Kvantifisering </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sek </td><td> 20 </td><td> Enkelt </td></tr><tr><td rowspan="3"> Smelte </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sek </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> None </td><td> None </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sek </td><td rowspan="2"> Kontinuerlig </td><td rowspan="2"> Smelte </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sek </td></tr></tbody></table> * Denne temperatur er amplikonet avhengig og vil bli redusert når det utføres MAAB

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Mens høy oppløsning smelte analyse gir evnen til å differensiere mellom enkelt-nukleotid polymorfismer i en heterogen populasjon, kan mutant allel forsterkning forspenning øke dens evne til å påvise tilstedeværende alleler ved relativt lave prosentandeler i en prøve. Denne protokollen beskriver forbedringer som forbedrer følsomheten av høy oppløsning smelteanalyse.

Metoder for å øke følsomheten av High Resolution Melting Enkelt nucleotide polymorphism Genotyping i Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

To metoder for Heterokaryon Dannelse å oppdage HCV Restriction faktorer

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D- og 3D-kromosommaleri i malariamygg

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimalisering av en høy gjennomstrømning Oppsett for å studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infeksjon som en modell for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Bruke overlegg analysen til Kvalitativt Mål Bakteriell Produksjon av og følsomhet for pneumokokk Bakteriociner

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Elektronmikroskopi av<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Type IV Sekresjon System Pili Produsert i varierende forhold av Iron tilgjengelighet

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell for måling av immunresponser mot Malaria i sammenheng med HIV Samtidig infeksjon

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder for å hemme bakterie Pyomelanin Produksjon og Bestem tilsvarende økning i Følsomhet for oksidativt stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

En rask metode for Blood Processing å øke utbyttet av Plasma Peptide nivåer i menneskeblod

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...