Name: methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Los autores agradecen a la Fundación Bill y Melinda Gates, por su apoyo al desarrollo de la tecnología y la formación.

Nota: Este protocolo incluye volúmenes y concentraciones de placa de 96 pocillos, tiras de 8 tubos, y los sistemas basados ​​en capilares (volumen de reacción de 10 l); Sin embargo, HRM también se puede realizar en sistemas basados ​​en placa de 384 pocillos con un volumen de reacción de 5 l escalando todos los volúmenes correspondientemente. El rango de detección para la mayoría de los sistemas es de 10 pg a 10 ng de ADN plantilla. 1. Preparar plantillas <ol><li> Obtener muestras de Plasmodium falciparum directamente de la sangre obtenida a partir de pacientes que participan en estudios sitio de campo y se almacena como sangre completa, glóbulos rojos sedimentadas, o sobre papel de filtro. Nota: Las muestras también pueden ser cultura-adaptado para crecer in vitro; algunas cepas estándar de laboratorio para su análisis se pueden pedir desde el Centro de Recursos para la Investigación y Referencia Reactivo Malaria (MR4, muestras se pueden usar directamente de glóbulos rojos o la cultura sedimentadas o extraídos de la sangre total, glóbulos rojos, o el papel de filtro. </li><li> ADN extraído depapel de filtro o cepas de cultivo adaptadas Nota: HRM es sensible a la concentración de sal; diferencias de concentración debido a los métodos de extracción variables pueden afectar significativamente las temperaturas de fusión. Mientras buffers finales específicos no son un factor importante para el éxito, utilizar una elución o resuspensión tampón estándar común (es decir, agua, 1x Te [&#39;baja Te&#39; o &#39;tampón de suspensión de ADN&#39;: 10 mM Tris-Cl, EDTA 0,10 mM] o 1x TE [10 mM Tris-Cl, EDTA 1 mM]) para todas las muestras para evitar las curvas de fusión anómalas o inconsistentes. <ol><li> Preparar diluciones plantilla de 10 pg -10 ng por l en la norma Te, TE o agua para cada reacción de 10 l. </li></ol></li><li> La amplificación directa de los glóbulos rojos sedimentados <ol><li> Determinar la parasitemia de los glóbulos rojos mediante microscopía de frotis delgado Nota: Los métodos para determinar la parasitemia de los glóbulos rojos infectados se encuentran disponibles en los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Diluir parasitemias por encima de 0,5% 1: 400 en PCR grado agua, TE, o Te. Utilice 3 l para cada 5- 10 l de reacción. </li></ol></li><li> Controles Nota: HRM se puede utilizar para el escaneado gen para detectar variantes de la secuencia en una población 12; Sin embargo, el genotipado precisa requiere siendo interrogado normas secuencia verificada para contener el SNP. Constructos de plásmido o malaria aislamientos con genotipos conocidos pueden ser utilizados. Para la mayoría de aplicaciones, 3D7 (MR4 MRA-151) se utiliza como un control de tipo salvaje. Debido a la variabilidad entre las carreras, siempre incluyen controles positivos y negativos. <ol><li> Los controles positivos: Prepare 10 pg - 10 ng por 1 mu l diluciones de plásmido o normas con genotipos SNP secuencia verificada. </li><li> Control negativo: agua de calidad de uso PCR como un control sin plantilla (NTC) para las reacciones de amplificación. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Amplificación por PCR <ol><li> Preparar mezcla de reacción <ol><li> Capa de aceite (opcional) Mineral. Nota: Algunos sistemas de gestión de recursos humanos son plataformas de fusión independientes y no tienen una tapa térmica para evitar la condensación y la evaporación del producto durante la amplificación. <ol><li> Añadir 20 l de aceite mineral ligero a cada placa bien antes de cargar la mezcla de reacción. </li></ol></li><li> Preparar 10x stocks de trabajo de todos los ensayos <ol><li> Consulte la Tabla 1 para 10x concentraciones de valores de trabajo recomendadas, así como concentraciones finales de genotipado HRM basada en sondeos bloqueado. </li></ol></li><li> Preparar las mezclas de reacción <ol><li> A cada pocillo de la placa o tubo, añadir 1 l de 10x madre de trabajo adelante y cebadores y sondas, 4,0 inversa - 2,5x o 2,0x HRM mezcla 5,0 l maestro, 1 l de plantilla, y el agua de grado PCR para un volumen total de reacción de 10 l . </li></ol></li><li> Pestillo o tubos <ol><li> Utilice óptica placa sEALS para la amplificación basada en la placa, tapones ópticos para los sistemas basados ​​en la tira de Tubo y tapones de plástico para sistemas basados ​​en capilares. Sé cobertura de seguro es completa y platos y tapas están completamente sellada y asegurada para evitar la evaporación durante la amplificación. </li></ol></li><li> Muestras de Spin <ol><li> Placas de Spin 3 min a 1800 xg para eliminar burbujas de aire y para separar las fases oleosa y acuosa si se usa aceite mineral. </li></ol></li></ol></li><li> Protocolo de amplificación <ol><li> Colocar placas de reacción o tubos en el termociclador. Protocolos sonda bloqueada o MAAB amplificación estándar Ejecutar (Tablas 2 y 3, respectivamente). Tenga en cuenta la diferencia en la temperatura de recocido entre estos métodos. </li></ol></li></ol> Análisis 3. HRM <ol><li> Derretir <ol><li> Después de la amplificación por PCR, continúe con el análisis de fusión. Para sistemas de fusión independientes que no se han incorporado en la amplificación (por ejemplo., Sistemas BIOFIRE Defensa LightScanner), remover la placa amplificado de termociclador y colocar en instrumento de gestión de recursos humanos. Desde la interfaz de software del sistema, fundir la placa de la 40 - 80 ° C para producir tanto la sonda de amplicón y picos de fusión. Nota: Para guardar fusión y análisis de tiempo, la ventana de fusión se puede acortar para cubrir los rangos de temperatura por sólo sondear o regiones de fusión amplicón. Después de la fusión, las placas y los tubos pueden ser re-fundieron si es necesario y se almacena a -20 ° C o 4 ° C. Tubos de vidrio Conservar sólo a 4 ° C para evitar que los tubos se agriete. </li></ol></li><li> Análisis Melt <ol><li> Retire las muestras negativas <ol><li> Dentro del software de análisis, retirar de nuevas muestras de análisis que no amplificar o que tienen picos de fusión dentados. Nota: Después de seleccionar el modo de análisis de un archivo de ejecución individuales, el instrumento automáticamente grupos de las muestras positivas y negativas. Antes de genotipificación de cada subconjunto, el usuario puede alterar manualmente las llamadas. <ol><li> Ya sea de la fusióncurva o pico de fusión vista, haga clic en las curvas para ser removido para seleccionarlos. Después de seleccionar las muestras mal clasificados, vaya a &quot;Nueva llamada&quot;, seleccione la agrupación apropiada y haga clic en &quot;Aplicar Cambio&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Normalizar <ol><li> Desde el derivado negativo de fluorescencia normalizada con respecto a la temperatura (-df / dT) (&#39;Curvas diferencia &quot;) visión, mover las barras de normalización para rodear la sonda fundir región. Nota: La sonda se funden región es la temperatura más baja de las dos regiones de fusión. Las barras de normalización deben estar en la base de los picos de fusión. </li></ol></li><li> Calcular los grupos <ol><li> Después de la normalización, seleccione &#39;Calcular grupos&#39; para asignar automáticamente las muestras a los grupos. Si es necesario muestras, a asignar volver manualmente a grupos específicos. Nota: Algunos programas de análisis tiene umbrales de alta sensibilidad que no se pueden cambiar; en estos casos, la software podría asignar muestras a diferentes grupos que pertenecen visualmente a otra. </li></ol></li><li> Asignar genotipos <ol><li> Asignar genotipos para cada grupo basado en estándares (controles positivos). <ol><li> Después de que el usuario confirma que los grupos calculados son correctos (si no es así, que los cambios correctos se han hecho en la pestaña Agrupación seleccionando muestras mal clasificados y seleccionando el grupo desde el primer cuadro desplegable al lado de &quot;Nueva llamada&quot;), seleccione &quot;Editar nombres de grupo &quot;bajo la pestaña&quot; Agrupación &quot;. </li><li> Introduzca los genotipos de las normas en el cuadro de color correspondiente (por ejemplo, si 3d7 estándar tiene un conocido Un genotipo y está en el grupo rojo, el grupo rojo tiene el genotipo A). Pulse el botón &quot;Aceptar&quot; y guardar los resultados. </li></ol></li></ol></li><li> Exportación de resultados <ol><li> Genotipo Exportación llama como una hoja de cálculo para su posterior análisis muestra de población. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. 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T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Continua HRM es una etapa de análisis post-PCR; Por lo tanto, la muestra y la configuración de ensayo es similar a protocolos de PCR estándar, con la incorporación adicional de un colorante intercalante fluorescente utilizado para rastrear la transición de doble cadena a ADN monocatenario durante la etapa de fusión de alta resolución. El factor más importante para el análisis de gestión de recursos humanos con éxito es un producto de PCR robusto. Diseño del ensayo es la clave, y varias herramientas optimizadas para el diseño de ensayo de gestión de recursos humanos están disponibles en el mercado y en línea 13. Longitudes de amplificación de 80-150 pares de bases con el acompañamiento de ~ 20 pares de bases bloquearon sondas sobrevolaron el SNP o SNP de interés el trabajo mejor para diferenciar SNPs y haplotipos de múltiples SNPs dentro de la región de la sonda. Las sondas pueden ser bloqueados usando un 3 &#39;C3 espaciador o un par desajuste 2 de base en el extremo 3&#39;, que impiden la extensión durante la amplificación. Las sondas se pueden diseñar para que coincida con la cadena de Watson Crick o plantilla; la eleccióndepende de la comprobación empírica para determinar qué sonda de diseño produce picos de fusión aceptables. El exceso hacia delante o hacia atrás primers se utilizan para producir producto de amplificación de cadena sencilla que hibrida con las sondas bloqueadas. Si la sonda contiene la secuencia de la cadena hacia adelante, luego cebador inverso se utiliza en exceso, por lo general en una proporción de 1: 5, y viceversa para las sondas que coinciden con la cadena inversa. Del mismo modo, HRM funciona mejor con suficiente y robusto producto de PCR. La optimización de la reacción PCR requiere geles de gradiente de PCR y análisis de agarosa o Bioanalyzer para determinar la temperatura óptima de recocido. Plantilla de concentración se puede aumentar usando métodos tales como pre-amplificación, la amplificación multiplexado sesgada de todos los objetivos utilizando concentración del cebador bajo y números de ciclo para aumentar la concentración de molde 13. Sólo un puñado de instrumentos son compatibles con MAAB. Las propiedades térmicas de los tubos capilares de vidrio usado in estos sistemas facilitan este método. El pequeño diámetro interior de los capilares, así como la rápida transferencia de calor a través del vidrio ofrecen un control de temperatura más riguroso que plasticware PCR estándar, que tiene tasas de transición más lentas de recocido entre ciclos de desnaturalización y debido a las propiedades de aislamiento térmico de los plásticos. Con este método, las sensibilidades de detección pueden reducirse a partir de 2-5% a menos del 1% de un alelo mutante en una mezcla de tipo salvaje y los alelos mutantes 10. Gestión de recursos humanos es una herramienta fácil, eficiente y económica para SNP genotipo en una variedad de configuraciones y numerosas aplicaciones, desde la vigilancia de enfermedades infecciosas para la exploración de variantes genéticas del cáncer. Varios otros instrumentos, como la Roche Nano y sistemas LightCycler (480 y 96), así como el Eco en tiempo real ofrece el sistema PCR HRM, además de la amplificación estándar, en tiempo real, y la funcionalidad de número de copias. El uso de máquinas de alto rendimiento, cuesta códigos de barras gestión de recursos humanos less de $ 0.50 por ensayo en nuestras manos, que incluye todos los reactivos y consumibles. En el contexto descrito aquí, las aplicaciones basadas en el terreno permiten la vigilancia de la población en tiempo real para los cambios asociados con los esfuerzos de control de la malaria, incluyendo reducida diversidad de la población, la detección de tipos de parásitos importados, y la aparición y propagación de SNPs asociados con una menor sensibilidad a los fármacos. Perfeccionamiento del método ofrecen sensibilidad adicional útil para informar el progreso hacia la eliminación de la malaria y erradicación.

A pesar del renovado interés en el control de la malaria y la erradicación, la malaria sigue siendo una carga para todo el mundo, con casi la mitad de la población mundial corre el riesgo de infección y más de 550.000 muertes al año, en particular los niños en África subsahariana 1. Estos nuevos programas de control y erradicación han sido apoyados por el renacimiento genómico, con un gran número de parásitos de la malaria secuenciados y analizados por mutaciones asociadas con una menor sensibilidad a los fármacos, el aumento de la virulencia y de características de la población 2,3. Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son algunas de las variantes genéticas más comúnmente identificados 4-7. Métodos portátiles genotipado de SNP ofrecen en el establecimiento y vigilancia de la población y en tiempo real el seguimiento de 8. Además de las huellas digitales de los parásitos individuales, el &quot;código de barras molecular también se utiliza para detectar cambios temporales dramáticos en frecuencia de los alelosasí como la variación del tamaño efectivo de la población y la complejidad de la infección 9. Si bien este conjunto de informativo SNPs se adapta fácilmente a muchas plataformas de genotipado, de alta resolución de fusión (GRH) análisis está particularmente bien adaptado a los estudios, en el funcionamiento y la detección de nuevas mutaciones en los bajos costos sensible y simple en comparación con la secuencia y otro campo de base enfoques son atractivos en entornos de escasos recursos. HRM comienza con la reacción en cadena de la polimerasa estándar (PCR) que incorpora un colorante fluorescente. Post-PCR análisis de fusión determina la temperatura máxima amplificación de fusión; una única diferencia de SNP en un corto amplicón puede resultar en sustancial de temperatura pico de fusión (Tm) diferencias. Varias mejoras a este método ofrecen mejor resolución genotipado para diferenciar SNPs incluidos SNPs clase IV (AT), y detectar alelos mutantes de menor importancia en las muestras con múltiples alelos presentes (poliGinfecciones enomic). En primer lugar, los ensayos incorporan sondas cortas centrado sobre la región SNP, además de cebadores directo e que están presentes en diferentes concentraciones revertir. Estas sondas bloqueados no se amplifican durante la PCR, pero se unen a la cadena producida en exceso debido a concentraciones de cebador asimétricos que aumentan la producción del producto sonda de plantilla. Estos amplicones de doble cadena separados formados por sonda unida al exceso cadena molde son ~ 20-30 pb; su longitud disminuyó significativamente en comparación con todo el amplicón (de 80-150 pb) conducen a diferencias mucho más grandes Tm asociados con la base única o múltiple sonda de plantilla desajustes 10. En segundo lugar, el sesgo de amplificación alelo mutante (MAAB) reduce la temperatura de recocido reacción al sesgo la reacción hacia alelos mutantes presentes en bajas proporciones en las infecciones polygenomic. La temperatura de hibridación se establece entre las Tms de perfectamente coincidente (de tipo salvaje) y coinciden sonda (mutante)s. A esta temperatura, la unión del alelo de tipo salvaje es lo suficientemente estable que la amplificación se ve obstaculizado en comparación con su falta de coincidencia equivalente, sesgando así la amplificación hacia el alelo mutante cuando ambos están presentes en una sola muestra 10. Con estos refinamientos HRM, esta tecnología ha permitido el seguimiento de los orígenes y la identidad de parásitos asociados con infecciones epidémicas en América del Sur 11 y la detección de nuevas mutaciones, diferenciación de múltiples SNPs situados inmediatamente uno junto al otro en secuencia, y las mutaciones presentes en menos de 1 % de los alelos en muestras polygenomic 10. Aumento de la sensibilidad es particularmente importante en las regiones que se acercan estado de pre-eliminación y aquellos en riesgo de emergente resistencia a los medicamentos. La capacidad para identificar rápida y fácilmente los parásitos y SNPs importados asociados con una menor sensibilidad en el sitio informa los esfuerzos de vigilancia y los programas de control sobrela efectividad de sus implementaciones e identifica puntos de acceso para mayores esfuerzos de erradicación de la malaria y de eliminación. Este protocolo describe los métodos para la sonda bloqueado con sede y MAAB para una mayor sensibilidad genotipado HRM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

A pesar de décadas de esfuerzos de erradicación, la malaria sigue siendo una carga global. Renovado interés reciente en la eliminación regional y la erradicación mundial se ha visto acompañado por un aumento de la información genómica sobre Plasmodium especies de parásitos responsables de la malaria, incluyendo características de las poblaciones geográficas, así como las variaciones asociadas con susceptibilidad reducida a los medicamentos contra la malaria. Una variación genética común, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), ofrece objetivos atractivos para el genotipado parásito. Estos marcadores son útiles no sólo para el seguimiento de los marcadores de resistencia a los medicamentos, sino también para el seguimiento de las poblaciones de parásitos utilizando marcadores no menores de drogas u otras presiones selectivas. Métodos de genotipificación de SNP ofrecen la posibilidad de realizar un seguimiento de resistencia a los medicamentos, así como tomar las huellas dactilares parásitos individuales para la vigilancia de la población, sobre todo en respuesta a los esfuerzos de control de la malaria en regiones acercan Eliminatestado iónico. Mientras SNPs informativos han sido identificados que son agnósticos a las tecnologías de genotipado específicos, de alta resolución de fusión (GRH) análisis es especialmente adecuado estudios basados ​​campo-a. En comparación con los métodos estándar fluorescente sonda basados ​​que requieren SNPs individuales en una sola sonda marcada y ofrecen, en el mejor 10% de sensibilidad para detectar SNPs en muestras que contienen múltiples genomas (polygenomic), gestión de recursos humanos ofrece 2.5% de sensibilidad. Modificaciones a HRM, tales como sondas bloqueadas y concentraciones de cebador asimétricos, así como la optimización de temperaturas de recocido de amplificación para PCR sesgo hacia la amplificación de la alelo menor, aumentar aún más la sensibilidad de HRM. Aunque la mejora de sensibilidad depende del ensayo específico, hemos aumentado la sensibilidad de detección a menos del 1% del alelo menor. En las regiones se acercan a la erradicación de la malaria, la detección temprana de emergentes o resistencia a los medicamentos importados es esencial para la prrespuesta OmpT. Del mismo modo, la capacidad de detectar infecciones polygenomic y diferenciar tipos de parásitos importados de embalses locales crípticas puede informar a los programas de control. Este manuscrito describe modificaciones a la tecnología de fusión de alta resolución que aumentan aún más su sensibilidad para identificar infecciones polygenomic en muestras de pacientes.

Los datos pueden ser visualizados en varias maneras diferentes, dependiendo del software de análisis y el instrumento. Típicamente, un gráfico de la derivada negativa de la fluorescencia normalizada con respecto a la temperatura (-df / dT) contra los resultados de temperatura es más sencilla para la visualización de picos de fusión y la determinación de los genotipos. Una ventana de fusión completa (40 ° C-80 ° C) resultará en ambas regiones de amplicón y de fusión de la sonda. La Figura 1 muestra un ejemplo de picos de fusión normalizados para ambas regiones. Configuración de la ventana de análisis sólo a los resultados de la región de la sonda en la diferenciación clara de picos correspondientes a SNPs específicos (Figura 2). Análisis basado-Probe muestra claramente la presencia de ambos alelos como picos individuales con temperaturas de fusión que coincidan con los picos de SNP homocigóticos (Figura 3). La Figura 4 muestra que progressively reducir la temperatura de recocido durante la amplificación (MAAB) da como resultado un sesgo hacia el alelo mutante (pico-lado izquierdo) (Figura 4A), lo que resulta en aumento de la sensibilidad para el alelo mutante en una población de alelos mixtos (Figura 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figura 1. sonda y de fusión amplicón regiones. Trazado de la derivada negativa de la fluorescencia normalizada con respecto a la temperatura en un amplio resultados de la ventana de fusión en tanto la sonda (temperatura más baja) y picos de fusión amplicón que pueden ser analizados. (Adaptado de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2. Probe picos de fusión. Partidos perfectos (típicamente alelos de tipo salvaje) dar lugar a picos de fusión más altos (rojo), mientras que los desajustes SNP tienen temperaturas de fusión más bajos (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figura 3. Polygenomic picos de fusión. Cuando ambos alelos están presentes en una muestra, el análisis de gestión de recursos humanos basados ​​en sonda representa ambos alelos como curvas de dos picos (naranja) con picos que responden a muestras de un solo alelo (rojo y gris). (Adaptado de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una v más grande</a>ersión de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figura 4. Mutant amplificación alelo sesgo (MAAB). A. Progresivamente la reducción de la temperatura de recocido de amplificación de la reacción sesgos pico de fusión hacia pico correspondiente al alelo mutante (temperatura más baja) en una muestra polygenomic o polyallelic. B. MAAB resulta en la sensibilidad para detectar HRM menor alelos presentes en menos de 1% en muestras polygenomic o polyallelic. (Parte B adaptado de Daniels et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Tabla 1. Configuración de alta resolución de las reacciones de amplificación de fusión basada en la sonda. <table><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen por reacción (96 pocillos placa y tubo capilar) </td><td> Volumen por reacción (384 pocillos placa) </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4.5 l </td><td> 2-2,5 l </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x exceso de imprimación </td><td> 1 l </td><td> 0.5 l </td><td> 0,50 M </td></tr><tr><td> 10 x otro cebador </td><td> 1 l </td><td> 0.5μl </td><td> 0.1 M </td></tr><tr><td> 10x Sonda </td><td> 1 l </td><td> 0.5 l </td><td> 0,40 M </td></tr><tr><td> Agua PCR grado </td><td> 2.1 l </td><td> 0.5-1 l </td><td></td></tr><tr><td> El ADN molde </td><td> 1 l </td><td> 0.5 l </td><td> 0,01-10 ng / l </td></tr><tr><td></td><td> 10 l </td><td> 5 l </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Standard alta resolución de las condiciones de amplificación de fusión. <table><tbody><tr><td> La temperatura </td><td> Hora </td></tr><tr><td> Mantener </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 ciclos </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 ciclo </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sec </td></tr></tbody></table> * Esta temperatura es dependiente de amplicón Tabla 3. Las condiciones de amplificación para la amplificación alelo mutante sesgo. <table><tbody><tr><td> La temperatura </td><td> Hora </td><td> Ciclos </td><td> Tasa de rampa </td><td> Modo de adquisición </td><td> Modo de análisis </td></tr><tr><td> Desnaturalizar </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Ninguno </td&gt; <td> Ninguno </td></tr><tr><td rowspan="2"> Ciclo </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sec </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Ninguno </td><td rowspan="2"> Cuantificación </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sec </td><td> 20 </td><td> Soltero </td></tr><tr><td rowspan="3"> Derretir </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sec </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> Ninguno </td><td> Ninguno </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sec </td><td rowspan="2"> Continua </td><td rowspan="2"> Derretir </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sec </td></tr></tbody></table> * Esta temperatura es amplicón-dependiente y se reducirá cuando se realiza MAAB

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

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