Name: methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Författarna tackar Bill och Melinda Gates Foundation för dess stöd av teknisk utveckling och utbildning.

Notera: Detta protokoll omfattar volymer och koncentrationer för 96-brunnars platta, 8-tube remsor, och kapillära baserade system (10 | il reaktionsvolym); emellertid kan HRM också genomföras i 384-brunnars plattbaserade system med en 5 | il reaktionsvolym genom att skala alla volymer motsvarande grad. Utbudet av detektion för de flesta system är 10 pg till 10 ng mall-DNA. 1. Förbered Mallar <ol><li> Erhåll Plasmodium falciparum prover direkt från blod erhållet från patienter som deltog i fält språk studier och lagras som helblod, pelleterade röda blodkroppar, eller på filterpapper. Notera: Prov kan också vara kultur-anpassad att växa in vitro; några vanliga laboratoriestammar för analys kan beställas från Malariaforskning och Reference Reagent Resource Center (MR4, kan Prover användas direkt från pelleterade röda blodkroppar eller kultur eller extraheras från helblod, röda blodkroppar, eller filterpapper. </li><li> DNA som extraherats frånfilterpapper eller kulturanpassade stammar Obs: HRM är känslig för saltkoncentrationen; koncentrationsskillnader på grund av varierande extraktionsmetoder kan väsentligt påverka smälttemperaturer. Även om specifika slut buffertar är inte en viktig faktor för framgång, använda en vanlig gemensam eluering eller resuspensionsbuffert (dvs vatten, 1x Te [&quot;låg Te&quot; eller &quot;DNA fjädring buffert&quot;: 10 mM Tris-Cl, 0,10 mM EDTA] eller 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) för alla prover för att undvika onormala eller inkonsekventa smältkurvor. <ol><li> Förbered mall utspädningar av 10 pg -10 ng per il i standard Te, TE, eller vatten för varje 10 pl reaktion. </li></ol></li><li> Direkt förstärkning från pelleterade röda blodkroppar <ol><li> Bestämma parasitemi av röda blodkroppar med användning av tunn-smear mikroskopi Obs: Metoder för bestämning parasitemi av infekterade röda blodkroppar är tillgängliga från Centers for Disease Control and Prevention (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Späd parasitemias över 0,5% 1: 400 i PCR-kvalitet vatten, TE eller Te. Använd 3 pl för varje 5- 10 pl reaktion. </li></ol></li><li> Kontroller Obs: HRM kan användas för gen scanning för att detektera sekvensvarianter i en population 12; kräver dock noggrann genotypning standarder sekvens verifierat att innehålla SNP förhörs. Plasmidkonstruktioner eller malaria isolat med kända genotyper kan användas. För de flesta tillämpningar är 3D7 (MR4 MRA-151) användes som en kontroll av vildtyp. På grund av mellan-run variabilitet alltid inkludera positiva och negativa kontroller. <ol><li> Positiva kontroller: Förbered 10 pg - 10 ng per 1 pl utspädningar av plasmid eller standarder med sekvens verifieras SNP genotyper. </li><li> Negativ kontroll: Använd PCR-kvalitet vatten som en no-mall kontroll (NTC) för amplifieringsreaktionerna. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR-amplifiering <ol><li> Framställ reaktionsblandning <ol><li> (Tillval) Mineralolja overlay. Obs! Vissa HRM-system är fristående smält plattformar och inte har en uppvärmd lock för att förhindra kondens och produkt förångning under förstärkning. <ol><li> Lägg 20 jil lätt mineralolja i varje brunnsplatta innan laddning av reaktionsblandningen. </li></ol></li><li> Förbered 10x arbets lager av alla analyser <ol><li> Se tabell 1 för rekommenderade 10x arbetsförrådskoncentrationer samt slutkoncentrationer för blockerad-sondbaserad HRM genotypning. </li></ol></li><li> Förbered reaktionsblandningar <ol><li> Till varje brunn i plåt eller rör, tillsätt 1 pl 10x arbets lager framåt och bakåt primers och prober, 4,0-5,0 pl 2.5x eller 2,0x HRM mästare mix, 1 pl mall och PCR-kvalitet vatten för en total reaktionsvolym av 10 ^ . </li></ol></li><li> Täckplattor eller rör <ol><li> Använd optiska plattan seals för plattbaserad amplifiering, optiska lock för band tube baserade system, och plastlock för kapillära baserade system. Var noga med täckning är komplett och tallrikar och lock är helt slutna och säkras för att förhindra avdunstning under amplifiering. </li></ol></li><li> Spin prover <ol><li> Spin plattorna 3 min vid 1800 xg för att avlägsna luftbubblor och för att separera olja och vattenfaser, om mineralolja användes. </li></ol></li></ol></li><li> Amplifiering protokoll <ol><li> Placera reaktions plattor eller rör i termocyklern. Kör standard blockerad sond eller MAAB amplifieringsprotokoll (tabellerna 2 och 3, respektive). Notera skillnaden i glödgningstemperaturen mellan dessa metoder. </li></ol></li></ol> 3. HRM Analys <ol><li> Smälta <ol><li> Efter PCR-förstärkning, vidare till smältning analys. För fristående smält system som inte har inbyggd förstärkning (t ex., BioFire Defense LightScanner system), reflytta förstärkta plattan från termocyklern och placera i HRM instrument. Från systemprogramvaran gränssnittet smälta plattan 40-80 ° C för att producera både prob och amplikon smälttoppar. Obs! För att spara smältning och analystiden, kan smält fönstret kortas för att täcka temperaturintervall för bara sond eller amplikon smältregioner. Efter smältning, plattor och rör kan återsmältas om nödvändigt och förvarades vid -20 ° C eller 4 ° C. Butiks glasrör endast vid 4 ° C för att förhindra rören från sprickbildning. </li></ol></li><li> Smält analys <ol><li> Ta bort negativa prover <ol><li> Inom analysprogrammet, ta bort från ytterligare analysprover som inte förstärker eller som har ojämna smälttoppar. Obs: När du har valt läget analys för en enskild körning fil, instrumentet automatiskt grupper de positiva och negativa prover. Innan genotypning varje delmängd, kan användaren manuellt ändra samtalen. <ol><li> Från antingen smältningkurva eller smälttopp visa, högerklicka på kurvorna tas bort för att välja dem. När du har valt misclassified proverna, gå till &quot;Nytt samtal&quot; välj lämplig gruppering, och klicka på &quot;Apply Change&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Normalisera <ol><li> Från den negativa derivatan av normaliserade fluorescens med avseende på temperatur (-dF / dT) (&quot;Skillnad Kurvor) uppfattning flytta normaliserings barer att omge sonden smälta regionen. Obs: Sonden smältområdet är den lägre temperaturen av de två smältregioner. Normaliserings barer bör vara vid foten av smälttoppar. </li></ol></li><li> Beräkna grupper <ol><li> Efter normalisering väljer &quot;Beräkna grupper&quot; för att automatiskt tilldela prover till grupper. Om det behövs, manuellt åter tilldela prover till särskilda grupper. Obs! Vissa analysprogram har höga trösklar känslighet som inte kan ändras, i dessa fall, den software kan tilldela prover till olika grupper som visuellt tillhör en annan. </li></ol></li><li> Tilldela genotyper <ol><li> Tilldela genotyper för varje grupp baseras på standarder (positiva kontroller). <ol><li> Efter det att användaren bekräftar att de beräknade grupperna är korrekta (om inte, har att rätta förändringar gjorts under fliken Gruppering genom att välja misclassified prover och välja rätt grupp i listrutan bredvid &quot;Nytt samtal&quot;), välj &quot;Redigera gruppnamn &quot;under&quot; grupperingar &quot;-fliken. </li><li> Ange genotyper av standarderna till motsvarande färgade rutan (till exempel om standard 3D7 har en känd En genotyp och är i den röda gruppen, har den röda gruppen genotyp A). Tryck på &quot;OK&quot; och spara resultatet. </li></ol></li></ol></li><li> Export resultat <ol><li> Exportera genotyp samtal som ett kalkylark för ytterligare provpopulationsanalys. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence.">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171 (2008).</li><li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum.">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li><li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Kontinuerlig HRM är ett post-PCR-analys steget; därför är prov och analysinställnings liknar standard-PCR-protokoll, med den ytterligare inkorporering av en fluorescerande interkalerande färg som används för att spåra övergången från dubbelsträngade till enkelsträngat DNA under den högupplösta smältningssteg. Den enskilt viktigaste faktorn för en framgångsrik HRM-analys är en robust PCR-produkt. Analys design är nyckeln, och flera verktyg optimerade för HRM-analys designen är kommersiellt tillgängliga och på nätet 13. Amplicon längder av 80-150 baspar med tillhörande ~ 20 baspar blockerade prober centrerade över SNP eller SNP av intresse fungerar bäst att skilja SNP liksom haplotyper av flera SNP i sondregionen. Prober kan blockeras med användning av antingen en 3 &#39;C3 spacer eller en 2 basparfelpassning vid 3&#39; änden, vilket förhindrar förlängning under amplifiering. Sönder kan utformas för att passa Watson eller Crick schablonsträngen; valetberor på empiriska tester för att avgöra vilken sond designen ger acceptabla smälttoppar. Överskott framåt eller bakåt primrar används för att producera enkelsträngat amplifieringsprodukt som parar till de blockerade proberna. Om proben innehåller den främre strängsekvensen, sedan omvänd primer används i överskott, vanligen i ett 1: 5-förhållande, och vice-versa för prober som matchar den omvända strängen. På samma sätt fungerar HRM bäst med tillräcklig och robust PCR-produkt. PCR-reaktion optimering kräver lutning PCR och agarosgeler eller Bioanalyzer analys för att bestämma optimala glödgningstemperaturer. Kan ökas templatkoncentration användning av metoder såsom pre-förstärkning, partisk multiplex förstärkning av alla mål som använder låg primerkoncentration och cykelnummer för att öka templatkoncentration 13. Endast en handfull instrument är kompatibla med MAAB. De termiska egenskaperna hos glaskapillärer rör som används in dessa system underlättar denna metod. Den lilla innerdiameter kapillärerna samt snabb värmeöverföring genom glas erbjuda strängare temperaturreglering än standard-PCR plasten, som har långsammare övergångshastigheter mellan glödgning och denatureringscykler på grund av de värmeisolerande egenskaperna hos plast. Med denna metod, kan detektionskänslig minskas 2-5% till mindre än 1% av en mutant allel i en blandning av vildtyp och mutanta alleler 10. HRM är en enkel, effektiv och ekonomiskt verktyg för SNP genotypning i en mängd olika inställningar och många tillämpningar, från infektiös sjukdomsövervakning skanning för cancer genvarianter. Flera andra instrument, såsom Roche Nano och LightCycler system (480 och 96) samt Eco realtid PCR-system erbjudandet HRM i tillägg till standard förstärkning, i realtid, och copy-nummer funktionalitet. Med hjälp av högre genomströmning maskiner kostar HRM barcoding less än $ 0,50 per analys i våra händer, inklusive alla reagenser och förbrukningsvaror. I den kontext som beskrivs här, fältbaserade program kan i realtid befolkningen övervakning av förändringar i samband med malariastyrningansträngningar, bland annat minskad befolkningstäthet, detektion av importerade parasittyper och utseende och spridningen av SNP i samband med minskad läkemedelskänslighet. Förbättringar av metoden ger ytterligare känslighet användbar för att informera framsteg mot malaria eliminering och utrotning.

Trots förnyade intresset för malariastyrning och utrotning förblir malaria en global börda, med nästan hälften av världens befolkning löper risk att smittas och mer än 550.000 dödsfall årligen, särskilt barn i Afrika söder om Sahara 1. Dessa nya program bekämpnings- och utrotnings har fått stöd av iska renässans, med ett stort antal malariaparasiter sekvense och analyserades med avseende mutationer associerade med minskad läkemedelskänslighet, ökad virulens, och befolkningsrelaterade särdrag 2,3. Single-nucleotide polymorphisms (SNP) är bland de vanligaste identifierade genetiska varianter 4-7. Bärbara SNP genotypning metoder erbjuder på plats och realtids befolkningen övervakning och spårning 8. Förutom att fingeravtryck enskilda parasiter, är den &quot;molekylära streckkod&quot; också används för att upptäcka dramatiska tidsförskjutningar i allelfrekvenssamt variansen effektiv populationsstorlek och komplexitet infektion 9. Även om denna uppsättning av informativa SNP är lätt anpassas till många genotypning plattformar, hög upplösning smältning (HRM) analys är särskilt väl lämpad för fältbaserade studier, där känslig och enkel drift och upptäckt av nya mutationer vid låga kostnader jämfört med sekvensering och andra tillvägagångssätt är attraktiva i resurssvaga miljöer. HRM börjar med standardpolymeraskedjereaktion (PCR) som innefattar ett fluorescerande färgämne. Post-PCR smälta analys bestämmer topp amplikon smälttemperatur; en enda SNP skillnad på kort amplikonen kan innebära en betydande toppsmälttemperatur (Tm) skillnader. Flera förbättringar av denna metod ger bättre genotypning upplösning att skilja SNP inklusive klass IV (AT) SNP, och upptäcka mindre muterade alleler i prover med flera alleler (POLYGEnomic infektioner). Först analyserna införliva korta sönder centrerade över SNP regionen utöver framåt och bakåt primers som förekommer vid olika koncentrationer. Dessa blockerade prober inte amplifieras under PCR, men binder till strängen som produceras utöver grund av asymmetriska primerkoncentrationer som ökar produktionen av sond-mall produkt. Dessa separata dubbelsträngade amplicons bestående av sond bunden till överskottet mallsträngen är ~ 20-30 bp; deras minskade betydligt längd jämfört med den totala amplikon (80-150 bp) leder till mycket större Tm skillnader i samband med en eller flera bas probe-mall inte stämmer överens 10. För det andra, mutantallel förstärkning partiskhet (MAAB) sänker reaktions annealingtemperaturen att belasta reaktionen mot muterade alleler närvarande vid låga förhållanden i polygenomic infektioner. Glödgningstemperaturen ligger mellan TMS av perfekt matchade (vild-typ) och inkompatibla (mutant) sonds. Vid denna temperatur är den bindning av vildtyp-allelen stabil nog att amplifiering hindras jämfört med dess obalans motsvarande, sålunda förspänner amplifieringen mot den mutanta allelen när båda är närvarande i ett enda prov 10. Med dessa HRM förbättringar, har denna teknik tillåts spårning av ursprung och identitet av parasiter i samband med epidemiska infektioner i Sydamerika 11 och detektion av nya mutationer, differentiering av flera SNP ligger omedelbart intill varandra i följd, och mutationer förekommer i mindre än 1 % av alleler i polygenomic prov 10. Ökad känslighet är särskilt viktigt i regioner närmar före eliminering status och personer i riskzonen för nya läkemedelsresistens. Förmågan att snabbt och enkelt identifiera importerade parasiter och SNP i samband med minskad känslighet på plats informerar övervakningsinsatser och kontrollprogram omeffektiviteten i sina implementationer och identifierar hotspots för ökade ansträngningar malaria utrotning och eliminering. Detta protokoll beskriver metoder för blockerade-sondbaserad och MAAB för ökad HRM genotypning känslighet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Trots decennier av ansträngningar för att utrota förblir malaria en global börda. Senaste förnyat intresse för regional eliminering och global utrotning har åtföljts av en ökad genetisk information om Plasmodium parasitarter som ansvarar för malaria, inbegripet egenskaperna hos geografiska populationer samt variationer i samband med minskad känslighet för läkemedel mot malaria. En vanlig genetisk variation, single-nucleotide polymorphisms (SNP), erbjuder attraktiva mål för parasiten genotypning. Dessa markörer är användbara inte bara för att spåra drogresistensmarkörer, men också för att spåra parasit populationer med hjälp av markörer som inte faller under läkemedel eller andra selektionstryck. SNP genotypning metoder erbjuder möjligheten att spåra läkemedelsresistens samt att ta fingeravtryck individuella parasiter för övervakning befolkningen, särskilt som svar på malariastyrningansträngningar i regioner närmar eliminatjon-status. Medan informativa SNP har identifierats som är agnostiker särskilda genotypning teknik, hög upplösning smältning (HRM) analys särskilt lämpad för fältbaserade studier. Jämfört med standardfluorescenssondbaserade metoder som kräver enskilda SNP i en enda märkt sond och erbjuder i bästa fall 10% känslighet för att upptäcka SNP i prover som innehåller flera genomen (polygenomic) erbjuder HRM 2-5% känslighet. Ändringar av HRM, såsom blockerade prober och asymmetriska primerkoncentrationer samt optimering av förstärknings glödgningstemperaturer till partiskhet PCR mot förstärkning av den mindre vanliga allelen, ytterligare öka känsligheten av HRM. Medan känslighets förbättringen beror på den specifika analysen har vi ökat detektionskänsligheter till mindre än 1% av den mindre vanliga allelen. I regioner som närmar sig utrotning malaria, är en förutsättning för pr tidig upptäckt av nya eller importeras läkemedelsresistensompT respons. På samma sätt kan förmågan att upptäcka polygenomic infektioner och differentiera importerade parasittyper från kryptiska lokala reservoarer informera kontrollprogram. Detta manuskript beskriver ändringar hög upplösning smältteknik som ytterligare ökar dess känslighet för att identifiera polygenomic infektioner i patientprover.

Data kan visualiseras på flera olika sätt, beroende på analysprogrammet och instrumentet. Typiskt är ett diagram över den negativa derivatan av normaliserad fluorescens med avseende på temperatur (-dF / dT) mot temperatur resulterar mest okomplicerade för att visualisera smälttoppar och bestämma genotyper. En fullständig smältfönster (40 ° C-80 ° C) kommer att resultera i både amplikon och sondsmält regioner. Figur 1 visar ett exempel på normaliserade smälttoppar för båda regionerna. Ställa analysfönstret till bara sondregionen resulterar i klart differentiering av toppar som motsvarar specifika SNP (Figur 2). Sondbaserad analys visar tydligt närvaron av båda allelerna som individuella toppar med smälttemperaturer som matchar homozygota SNP toppar (Figur 3). Figur 4 visar att progressitivt reducera glödgningstemperaturen under amplifiering (MAAB) resulterar i en förspänning mot den mutanta allelen (vänster sida topp) (Figur 4A), vilket resulterar i ökad känslighet för den mutanta allelen i en population av blandade alleler (figur 4B). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figur 1. Probe och amplicon smält regioner. Plotta den negativa derivatan av den normaliserade fluorescens med avseende på temperatur över ett brett smält fönster resulterar i både sond (lägre temperatur) och amplikon smälttoppar som kan analyseras. (Anpassad från Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Figur 2. Probe smälttoppar. Perfekta matcher (typiskt vildtyp alleler) resulterar i högre smälttoppar (röd), medan SNP felpassningar har lägre smälttemperaturer (grå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figur 3. Polygenomic smältande toppar. När båda alleler förekommer i ett prov, representerar sondbaserad HRM analys båda allelerna som två-topp kurvor (orange) med toppar som matchar enkel allelen prover (röd och grå). (Anpassad från Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större v</a>ersion av denna siffra. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figur 4. Mutant allelen förstärkning partiskhet (MAAB). A. Successivt sänka förstärkningen glödgningstemperaturen förspänner smälttopp reaktionen mot topp motsvarande mutanten (lägre temperatur) allelen i en polygenomic eller polyallelic prov. B. MAAB resulterar i HRM sensitivitet för att detektera mindre alleler som är närvarande vid mindre än 1% i polygenomic eller polyallelic prover. (Del B anpassas från Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Tabell 1. Ställ upp sondbaserade högupplösta smält amplifieringsreaktioner. <table><tbody><tr><td> Komponent </td><td> Volym per reåtgärden (96-brunnsplatta och kapillärrör) </td><td> Volym per reaktion (384-brunnar) </td><td> Slutlig koncentration </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4-5 ^ il </td><td> 2-2,5 il </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x Överskott primer </td><td> 1 pl </td><td> 0,5 pl </td><td> 0,50 ^ M </td></tr><tr><td> 10 x Andra primer </td><td> 1 pl </td><td> 0.5μl </td><td> 0,1 ^ M </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 pl </td><td> 0,5 pl </td><td> 0,40 ^ M </td></tr><tr><td> PCR-kvalitet vatten </td><td> 1-2 ^ il </td><td> 0,5-1 | il </td><td></td></tr><tr><td> Mall-DNA </td><td> 1 pl </td><td> 0,5 pl </td><td> 0,01-10 ng / l </td></tr><tr><td></td><td> 10 pl </td><td> 5 pl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 2. Standard högupplösta smält amplifieringsbetingelser. <table><tbody><tr><td> Temperatur </td><td> Tid </td></tr><tr><td> Hålla </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sek </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 cykler </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 cykel </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sek </td></tr></tbody></table> * Denna temperatur är amplikon beroende Tabell 3. Amplifieringsbetingelserna för mutant allel förstärkning partiskhet. <table><tbody><tr><td> Temperatur </td><td> Tid </td><td> Cykler </td><td> Ramphastighet </td><td> Moden </td><td> Analysläge </td></tr><tr><td> Denaturera </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sek </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Ingen </td&gt; <td> Ingen </td></tr><tr><td rowspan="2"> Cykel </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sek </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Ingen </td><td rowspan="2"> Kvantifiering </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sek </td><td> 20 </td><td> Enda </td></tr><tr><td rowspan="3"> Smälta </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sek </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0,3 </td><td> Ingen </td><td> Ingen </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sek </td><td rowspan="2"> Kontinuerlig </td><td rowspan="2"> Smälta </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sek </td></tr></tbody></table> * Denna temperatur är amplikon beroende och kommer att minskas vid utförande MAAB

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria at JoVE.com

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Även hög upplösning smältanalys ger möjlighet att skilja mellan single nucleotide polymorphisms i en heterogen population, kan mutant allel förstärkning partiskhet öka sin förmåga att upptäcka alleler närvarande vid relativt låga procenttal i ett prov. Detta protokoll beskriver förbättringar som förbättrar känsligheten för hög upplösning smältanalys.

Metoder för att öka känsligheten för högupplöst Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping i Malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protokoll för produktion av en genetisk kors av parasiterna Gnagare Malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Två metoder för heterokaryonbildning att upptäcka HCV Restriction Faktorer

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D- och 3D-kromosommålning i malariamyggor

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Upprättande och optimering av en hög genomströmning Setup för att studera<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Och<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion som en modell för Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Använda Overlay-analys för att Kvalitativt Mät Bakteriell Produktion av och känslighet för pneumokockinfektioner bakteriociner

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Högupplöst elektronmikroskopi av<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Typ IV sekretionssystemet Pili Producerad i varierande förhållanden of Iron Tillgänglighet

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell för mätning av immunsvar mot malaria som led av HIV-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder för att inhibera bakteriell Pyomelanin Produktion och Bestäm motsvarande ökning i känslighet för oxidativ stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

En snabb metod för blodbehandlings att öka utbytet av plasmapeptidnivåer i Människoblod

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...