Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Studiet af vært / patogen interaktioner har vist sig at være en bemærkelsesværdig metode til at forstå bakterielle infektioner og udvikle alternative strategier til infektionssygdomme. Men på grund af mangfoldigheden af ​​strategier udarbejdet af forskellige bakterielle patogener, identifikation og karakterisering af bakterielle virulensfaktorer og værten signalveje, der er målrettet under infektioner udgør en reel udfordring. Det kræver udvikling af nye metoder til storstilet identifikation af centrale vært / patogen interaktion hubs. Den nylige udvikling af innovative, high-throughput og høj-indhold screeningsteknikker repræsenterer en uvurderlig ressource, der kan tilpasses til studiet af intracellulære bakterielle patogener 15. Her har vi brugt den zoonotiske bakterielt patogen Coxiella burnetii som model til at udvikle screening tilgange, der kombinerer transposon mutagenese og fluorescens assays. Importantly, denne screeningsmetode muliggør samtidig overvågning af flere trin i Coxiella intracellulære cyklus, hvilket giver et samlet overblik over strategier udviklet af denne bakterie til at invadere, replikere og persistere i inficerede celler. Den her beskrevne fremgangsmåde er baseret på to veletablerede teknikker, transposon mutagenese og fluorescens-baserede assays, som er blevet anvendt med succes til studiet af bakterielle patogener. Kombinere disse teknikker i forbindelse med high-throughput / high-content skærme giver os mulighed for at vurdere virkningerne af et stort antal bakterielle mutationer ved at analysere et meget stort antal af hændelser (typisk 15.000 inficerede celler pr bakterielle mutationer afbildes og analyseres). Dette giver et vigtigt statistisk analyse af begivenheder, såsom bakteriel invasion af værtsceller og intracellulær replikation, som i sagens natur underlagt høj variabilitet. Det er vigtigt at bemærke, at celle bortset ep linjerithelial kan anvendes til denne type screening. Imidlertid flade og store epitelceller er optimale til billedanalyse som vært celleorganeller er lettere at afsløre. Fordi størstedelen af ​​automatiserede mikroskoper automatisk kan håndtere et stort antal plader, der er næsten ingen grænser for antallet af mutanter, der kan screenes samtidigt. Afhængig af patogenet, kan brugeren privilegium anvendelsen af ​​et epifluorescens eller et konfokalt mikroskop. Tidspunktet for billedregistrering vil mest afhænge af følsomheden af ​​mikroskopet kamera, om antallet af felter, der er erhvervet pr brønd og af antallet af kanaler, der er erhvervet pr synsfelt. Brugeren kan beslutte, hvordan man justere disse faktorer for at optimere screeningsprotokol. Som et eksempel, vi afbildes en plade med 96 brønde / time ved anvendelse af betingelserne angivet i punkt 5.1. Billedanalyse afhænger i høj grad på maskinen (eller klynge af maskiner), der anvendes. Vi bruger en 12-kerne (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM arbejdsstation. Denne maskine kræver indbyrdesende 40 min at analysere billeder erhvervet fra én plade. Et vigtigt aspekt, der skal tages i betragtning ved udviklingen af ​​disse assays er etableringen af ​​nye (eller optimering af eksisterende) protokoller for at tillade manipulation og bearbejdning af et stort antal prøver. Et typisk eksempel er udviklingen af den enkelt primer koloni-PCR tilgang, hvilket tillod os til hurtigt at amplificere og sekvens Coxiella DNA-fragmenter indeholdende insertionsstedet af hvert transposon, fra meget små prøver. Baseret på vores erfaring, high-fidelity-polymerase skal nøje udvalgt og testet for at opnå reproducerbare resultater. Den eneste begrænsning af denne fremgangsmåde kan gemme sig i den iagttagelse, at i de fleste tilfælde, ca. 30% af de behandlede prøver ikke udnyttes, enten som følge af PCR eller sekventering trin. Men i betragtning af at isolering af nye Coxiella transposonsekvenser mutanter er ikke en hastighedsbegrænsende trin, dette ikke repræsensendt et stort problem. Ligeledes har udviklingen af ​​en pålidelig analyse for at kvantificere den bakterielle koncentration af mutante bestande været nøglen for denne fremgangsmåde. På grund af tendensen til, Coxiella til at aggregere, når i suspension, anvendelse af absorbansaflæsningerne gælder ikke for beregning af koncentrationen af Coxiella kulturer og den eneste eksisterende alternativ var kvantitativ PCR (qPCR). Her er anvendelsen af ​​en fluorescens-mærkede DNA interkalationsmiddel signifikant fremskyndet bakterier kvantificering. Denne fremgangsmåde kan også drage fordel af anvendelsen af ​​stabile cellelinjer, der udtrykker fluorescerende markører for adskillige intracellulære rum afhængigt af patogenet anvendes. Et andet vigtigt aspekt er anvendelsen af ​​celledyrkningsmedier blottet for phenolrødt. Vi observerede, at denne pH-indikator har en naturlig fluorescens spænder over røde og grønne spektrum, mætter signalet optaget på automatiseret fluorescens-læser. THan strategi præsenteres her bygger på tilfældige transposon mutagenese. For mutanter af interesse, anbefaler vi validere unikke gennemførelser (og klonalitet) ved hjælp af Southern blot og PCR-amplifikationer af transposon insertion site. Udover det udstyr, der er beskrevet i protokollen afsnittet teams interesseret i at bruge screening metode præsenteres her, vil tage stor fordel i opsætningen af ​​en relationel database for indsamling af data, en server til lagring af data og en arbejdsstation til hurtig billedanalyse. Vigtigt er det, hvilken fremgangsmåde er beskrevet her er egnet til undersøgelse af andre intracellulære bakterielle patogener tilvejebragt en tilfældig mutagenese metode findes for patogenet, kan cellelinier blive inficeret af patogenet, og dette viser en specifik fænotype under infektion.

Den spirende, endemiske bakterie Coxiella burnetii er ansvarlig for store udbrud af Q-feber, en invaliderende influenzalignende zoonose med alvorlige sundheds- og økonomiske konsekvenser 1. De vigtigste reservoirer af Coxiella er indenlandske og husdyr, og det anslås, at mere end 90% af malkekvæg i USA bærer C. burnetii 2. Mennesker er tilfældige værter, der er smittet ved indånding af forurenede aerosoler. Menneskelig Q-feber manifesterer enten som en akut eller kronisk sygdom, som kan have fatale komplikationer med en dødelighed nåede 65% 1,3. Med en infektiøs dosis på 1 - 10 organismer, Coxiella er den mest infektiøse patogen kendes, og det er blevet undersøgt som en potentiel bio våben 4. Den nylige eksplosive udbrud af Q-feber i Nederlandene (2007 - 2010), med sager eskalerende fra 182 til mere end 2.000 året, står som et eksempel på den alvorlige virulens af dette patogen5. Den bemærkelsesværdige effektivitet Coxiella infektioner er sandsynligvis forbundet med dets resistens over for miljømæssig stress, kombineret med sin unikke tilpasning til værtsceller. Faktisk Coxiella er til stede i miljøet i form af metabolisk inaktive små celle-varianter (SCV), som er bemærkelsesværdigt modstandsdygtigt over for flere barske betingelser (udtørring, temperatur, etc.). Olieudtag er op taget af fagocytiske celler via α V β 3 integriner 6 mens invasion af ikke-fagocytiske celler medieres af Coxiella adhæsion / invasion OmpA 7 og en endnu uidentificeret receptor. Efter optagelse, Coxiella bosat i tætsiddende vakuoler, positive for de tidlige endosomale markører Rab5 og EEA1 8. Bakterier reagere på endosomal forsuring ved at konvertere til metabolisk aktive store celle varianter (lette erhvervskøretøjer) og aktivere en Dot / Icm type 4 sekretionssystem (T4SS) 9, Stærkt homolog med den for Legionella pneumophila 10. Udskillelsen af Dot / integrerede dyrkningsmetoder effektorer tillader Coxiella at generere et stort, LAMP1-positive sure rum indeholdende aktive lysosomale enzymer, hvor bakterier kan trives og aktivt beskytte inficerede celler fra apoptose 11. Derfor er den intracellulære cyklus af Coxiella kontrolleres af Dot / Icm-medieret translokation af bakterielle effektorer 12 imidlertid de mikrobielle faktorer involveret i værtscelle invasion, bakteriel replikation og udbredelse af infektionen forbliver stort set ukendt. Kombinere transposon mutagenese og fluorescens-baserede assays, udvikler vi uvildige metoder til samtidig identifikation af bakterielle faktorer involveret i de vigtigste trin af Coxiella infektioner: 1) internalisering inden værtsceller, 2) intracellulær replikation, 3) celle-til-celle-spredning og 4) vedholdenhed. Til dato har vi screenet over 1.000 mutations i 500 Coxiella kodende sekvenser, som gav os med hidtil usete indblik i værten-patogen interaktioner, der regulerer Coxiella patogenese 7. Af note, kan denne fremgangsmåde anvendes til studiet af andre intracellulære patogener, der deler cellebiologiske funktioner med Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion og kolonisering af værtsceller ved bakterielle patogener afhænge af aktiviteten af ​​et stort antal af prokaryote proteiner, defineret som virulensfaktorer, som kan nedbryde og manipulere centrale vært funktioner. Studiet af vært / patogen interaktioner er derfor yderst vigtigt at forstå bakterielle infektioner og udvikle alternative strategier til infektionssygdomme. Denne tilgang dog kræver udvikling af nye high-throughput assays til fordomsfri, automatiseret identifikation og karakterisering af bakterielle virulensdeterminanter. Her beskriver vi en fremgangsmåde til frembringelse af et GFP-mærket mutant bibliotek ved transposon-mutagenese og udvikling af høj-indhold screeningsmetoder til samtidig identifikation af multiple transposon-associerede fænotyper. Vores arbejdsmodel er det intracellulære bakterielle patogen Coxiella burnetii, det ætiologiske agens for zoonosen Q-feber, som er forbundet med SEvere udbrud med en deraf følgende sundhedsmæssige og økonomiske byrder. Den obligat intracellulære karakter af denne patogen har, indtil for nylig, alvorligt hæmmet identifikationen af bakterielle faktorer involveret i vært patogen interaktioner, hvilket gør af Coxiella den ideelle model for gennemførelse af high-throughput / højt indhold tilgange.

Efter isolering af transposon mutanter, enkelt primer koloni-PCR er en robust, high-throughput metode til at identificere stedet for transposon insertion for hver mutant. Denne fremgangsmåde følger af en typisk nested PCR-protokol, men her en enkelt primer hybridiserer specifikt og / eller ikke-specifikt til template-DNA afhængigt af stringensen af annealing temperatur (figur 1A). De typiske PCR-produkter består af flere DNA-fragmenter, hvoraf de fleste er specifikke (figur 1b). Anvendelsen af en anden sekventeringsprimer der annealer højre opstrøms for transposon ITR, og nedstrøms for den sekvens, der genkendes af amplificeringsprimeren tilvejebringer specificitet for sekventering trin (figur 1C). Automatiseret software til sekvensanalyse justerer de opnåede sekvenser til Coxiella genom levere præcise sted for transposoninsertioner (figur 1C). Alle transposoninsertioner kan være så annotated på Coxiella genom (figur 1D). Hver Coxiella mutant isoleres og amplificeres axenisk i ACCM-2 medium før enten lagring eller screening. Figur 2 illustrerer et eksempel på 38 transposon mutanter i 16 punkter / ICM Coxiella gener (figur 2A). For at vurdere levedygtigheden af Coxiella mutanter, der axeniske vækstkurver opnået ved prøveudtagning bakteriekulturer i 7 dage efter inokulering og anvende den bakterielle koncentration assayet beskrevet i 1.5 (Figurie 2B). Amplificerede mutanter inkuberes derefter med epitelceller, i tredobbelte plader med 96 brønde i 7 dage. Alle Coxiella frembragte mutanter bliver GFP-mærket, er intracellulære vækstkurver opnået ved måling af GFP-fluorescens intensiteten af hver brønd, hver 24 timer, og plotte de målte værdier som en funktion af tid (figur 2C). Intracellulære vækstkurver give kvantitative analyse af de fænotyper, der er forbundet med hvert transposon insertion i Coxiella genomet. For at tilføje kvalitative oplysninger om de samme transposonsekvenser mutanter, vi valgt indsamling og analyse automatiseret billede. Syv dage efter infektion, plader er faste, forarbejdet til immunfluorescens som beskrevet i 4 og analyseret ved hjælp af en automatiseret, epifluorescensmikroskop som beskrevet i 5. Automatiseret billedanalyse software som CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) behandler de tilkøbte kanaler selvstændigt og segmenter identificeres objekter for sammenlignende analyse (figur 3). Dette muliggør identifikation og morfologiske karakterisering af værtscellelinier kerner, celle konturer, lysosomer og Coxiella kolonier (figur 3 øverste paneler). Korrelering Coxiella kolonier med celler og lysosomer tillader identifikatom og specifik morfologisk analyse af Coxiella holdige vakuoler (som er LAMP1 positiv, figur 3 nederste venstre panel). Korrelering Coxiella kolonier med værtscelle konturer muliggør identifikation og specifik morfologisk analyse af inficerede celler (figur 3 nederst i midten panel). Endelig er de 4 kanaler fusioneret til illustration og kvalitetskontrol (figur 3 nederste højre panel). Data fra automatiseret billedanalyse kan plottes mod hinanden for at opnå &quot;flere fænotypiske scatter plots&quot;. Som et eksempel er i figur 4A det gennemsnitlige areal (i um 2) af Coxiella kolonier plottet mod antallet af kolonier per celle (Figur 4A), for at identificere mutationer, der påvirker intracellulær replikation af Coxiella (replikationsfænotype) og / eller evne bakterier at invadere værtsceller (internalization fænotype). Statistisk analyse blev anvendt til at definere regionerne i den resulterende scatter plot svarende til milde (-4 &lt;Z-score ≤ -2) og svær (Z-score ≤ -4) fænotyper. Mutanter blev observeret i 3 hovedgrupper: mutationer, der resulterede i et defekt intracellulær vækst i Coxiella blev grupperet i venstre meste af plottet (figur 4A, pink og røde prikker); mutationer, der er ramt Coxiella internalisering i celler blev grupperet i den nederste del af plottet (figur 4A, lys og mørk blå prikker) og endelig, grønne prikker i højre mest region af plottet svarer til mutationer resulterer i ikke-signifikante fænotyper ( Z-score&gt; -2). Vigtigt er det, mutanter, der ikke replikere, men er stadig i stand til at invadere værtsceller, detekteres efter 7 dages infektion som enkelte bakterier eller små kolonier, der støder op til vært cellekerner (figur 4C, andet panel). Dermed størrelsen af Coxiella &quot;coloselskaber &quot;vil blive væsentligt påvirket, men antallet af inficerede celler vil ikke variere i forhold til WT Coxiella inficerede celler. Tværtimod mutationer, der påvirker evnen af Coxiella at invadere værtsceller resultere i et fald i antallet af kolonier / celle. Når dette antal er væsentligt under 1, betyder det, at i gennemsnit er der et fald i det samlede antal inficerede celler. Alternativt kan den gennemsnitlige areal (i um 2) af Coxiella kolonier afsættes mod antallet af værtsceller overlever infektion (figur 4B), til at identificere mutationer, som bibringer cytotoksicitet til Coxiella (cytotoksisk fænotype). Som ovenfor blev statistisk analyse anvendes til at definere regionerne i den resulterende scatter plot svarende til milde (-4 &lt;Z-score ≤ -2) og svær (Z-score ≤ -4) fænotyper. Mest screenet mutationer påvirkede ikke signifikant celleoverlevelse uanset bakteriel replikation inden værtceller (figur 3B grønne prikker). 37 mutationer mildt påvirkede værtscelle overlevelse (figur 3B, lette røde prikker) og 7 mutationer var særligt skadelige for vært celleoverlevelse (figur 3B, mørke røde prikker). Bemærk, at yderligere parametre opnået ved automatiseret billedanalyse procedure kan anvendes til at udlede andre diagrammer, ifølge eksperimentelle behov. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figur 1:. Sekventering og annotation af Coxiella transposon mutanter (A) Single primer koloni-PCR anvendes til at opformere DNA-fragmenter indeholdende det sted transposon insertion. En amplifikation primer (Amp) anvendes både som en specifik og ikke-specifik primer afhængigt af stringensen af ​​annealing temperatur. (B) Typisk resultat af enkelt primer koloni-PCR. Hver Reactipå producerer en række fragmenter af forskellig størrelse, hvoraf nogle indeholder transposonet indsættelsesstedet; nogle andre er tilfældigt amplificeret som biprodukter af lav stringens PCR-cyklus. (C) Anvendelsen af en sekventeringsprimer (Seq), der hybridiserer til transposon-sekvensen tillader sekventering af fragmenterne af interesse. (D) Sekvensanalyse software gør det muligt automatisk annotation af transposoninsertioner på bakterielle genom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figur 2:. Axeniske og intracellulær vækst Coxiella transposonsekvenser mutanter (A) I pilot skærmen har vi isoleret, sekventeret og screenet 38 transposonsekvenser mutanter i 16 core gener af Coxiella dot / ICM sekretionssystem (angivet med rødt). (B) For at vurdere levedygtigheden af hvert transposon mutant, væksten af hvert isolat i axenisk dyrkningsmedium overvåges over 8 dage ved anvendelse af en fluorescens-mærkede DNA-interkalerende middel. (C) Hver mutant anvendes derefter til at inficere epithelceller. Som transposonen besidder en GFP-kassette, er intracellulær bakterievækst overvåget over 7 dage infektion ved at følge variationer af GFP-fluorescens forbundet med Coxiella replikering, ved hjælp af en mikropladelæser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figur 3: Automatiseret billedanalyse af Coxiella infektioner En automatisk.parret epifluorescensmikroskop bruges til billedet 21 positioner per brønd af tredobbelte plader med 96 brønde. De billedanalyse software segmenter objekter i hver erhvervede kanaler til kvantificering og analyse. I alle tilfælde er objekter rører grænsen af ​​billederne udelukket. (A) Hoechst kanal anvendes til at identificere host cellekerner (i cirkel med grønt). (B) Disse bruges som frø til at identificere værtscelleproteiner konturer i Cy3 kanal (positionen af kerner er omgivet i blå, celle konturer med grønt). (C) The Cy5-kanalen anvendes til at identificere LAMP1-positive rum (i cirkel med grønt); kun de objekter, der indgår i de tidligere identificerede celle konturer (i rødt) tilbage til billedanalyse. (D) Den GFP kanal anvendes til at identificere Coxiella kolonier (i cirkel med grønt). (E) Korrelere Coxiella kolonier med LAMP1-positive rum tillader identifikation af Coxiella </em&gt; holdige vakuoler (CCVs); kun de objekter, der indgår i de tidligere identificerede celle konturer (i grøn) tilbage til billedanalyse. (F) Korrelere Coxiella kolonier med celle konturer tillader identifikation af inficerede celler (pseudocolored). (G) Billeder erhvervet i de 4 fluorescens kanaler (svarende til Coxiella kolonier (grøn), host cellekerner (blå), værtscelle plasmamembranen (grå), LAMP1-positive rum (rød)) er slået sammen og anvendes til illustration og kvalitet kontrol. Scale barer 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figur 4: Storstilet identifikation af Coxiella faktorer involveret i vært / patogen interagererioner. (A) Det gennemsnitlige areal (i um 2) af Coxiella kolonier er plottet mod det relative antal kolonier pr celle, til at identificere replikation og internalisering fænotyper af interesse. Grønne prikker repræsenterer fænotyper, der afviger fra WT Coxiella af en Z-score&gt; -2 (ikke signifikant). Pink og lyseblå prikker repræsenterer replikation og internalisering fænotyper henholdsvis med en Z-score mellem -2 og -4 (milde fænotyper). Røde og mørkeblå prikker repræsenterer fænotyper med en Z-score ≤ -4 (stærke fænotyper). (B) Det gennemsnitlige areal (i um 2) af Coxiella kolonier blev plottet mod det totale antal celler (inficeret og ikke inficerede), der overlevede 7 dage infektion at estimere den cytotoksiske virkning af transposoninsertioner. Grønne prikker repræsenterer fænotyper, der afviger fra WT Coxiella af en Z-score&gt; -2 (ikke signifikant). Lyserøde prikker repræsenterer cytotoksiske phenotypes med en Z-score mellem -2 og -4 (milde fænotyper). Røde prikker repræsenterer cytotoksiske fænotyper med en Z-score ≤ -4 (stærke fænotyper). Pile angiver mutanter illustreret ved den tilsvarende lille bogstav i C. (C) Repræsentative billeder af replikation, internalisering og cytotoksiske fænotyper. I alle tilfælde host cellekerner er i rød, Coxiella kolonier med grønt. Scale barer 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii er en obligat intracellulær Gram-negativ bakterie er ansvarlig for zoonotisk sygdom Q-feber. Her beskriver vi fremgangsmåder til generering af Coxiella fluorescerende transposon mutanter samt automatiseret identifikation og analyse af de resulterende internalisering, replikations- og cytotoksiske fænotyper.

Generation og Multi-fænotypisk High-indhold Screening af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En genetisk skærm for at isolere Toxoplasma gondii Host-celle afstigningstrin Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Lettere Drug Discovery: En automatiseret High-indhold Betændelse Assay i zebrafisk

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fænotypisk analyse til kvantificering af intracellulære mycobakterier tilpasset til screening med højt gennemløb/højt indhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifikation af nye gener forbundet med Alginat Produktion i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Brug Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-medieret mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Udviklingen af ​​Frysetørret Loop-medierede Isotermiske Amplification reagenser til påvisning af<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Anvendelse fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) til at undersøge Effector translokationseffektivitet af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Høj overførselshastighed parallelle sekvensering til foranstaltning Fitness af Leptospira interrogans Transposon indsættelse mutanter under Golden syriske Hamster infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering af bestilt, Nonredundant bibliotek af Pseudomonas aeruginosa stamme PA14 Transposon indsættelse mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuelle og mikroskopiske evaluering af Streptomyces udviklingsmæssige mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...