Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

De studie host / pathogen interactions heeft bewezen een opmerkelijke methode om bacteriële infecties te begrijpen en alternatieve strategieën om infectieziekten teller. Vanwege de verscheidenheid aan strategieën, door verschillende bacteriële pathogenen, de identificatie en karakterisering van bacteriële virulentiefactoren en de ontvangende signaalroutes die zijn gericht bij infecties vormen een uitdaging. Dit vraagt ​​om de ontwikkeling van nieuwe benaderingen voor de grootschalige identificatie van de belangrijkste gastheer / ziekteverwekker interactie hubs. De recente ontwikkeling van innovatieve, high-throughput en high content technieken vertegenwoordigt een waardevolle grondstof die kan worden aangepast aan de studie van intracellulaire bacteriële pathogenen 15. Hier hebben we de zoönotische bacteriële ziekteverwekker Coxiella burnetii gebruikt als model voor selectie technieken die transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays combineren ontwikkelen. ImportanTLY, laat deze screening methode de gelijktijdige monitoring van meerdere stappen van de Coxiella intracellulaire cyclus, het verstrekken van een globaal overzicht van de strategieën ontwikkeld door deze bacterie binnen te vallen, te repliceren en blijven binnen de geïnfecteerde cellen. De hier beschreven benadering is gebaseerd op twee gevestigde technieken, transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays, die met succes toegepast op de studie van bacteriële pathogenen. De combinatie van deze technieken in de context van high-throughput / high content schermen kunnen wij de effecten van een groot aantal bacteriële mutaties te beoordelen door het analyseren van een zeer groot aantal events (typisch 15.000 geïnfecteerde cellen per bacteriële mutaties worden afgebeeld en geanalyseerd). Dit levert een belangrijke statistische analyse van gebeurtenissen zoals bacteriële invasie van gastheercellen en intracellulaire replicatie, die, van nature, aan hoge variabiliteit. Het is belangrijk op te merken dat andere dan ep cellijnenithelial kan worden gebruikt voor dit type onderzoek. Echter, vlakke en grote epitheelcellen zijn optimaal voor beeldanalyse als gastheer celorganellen gemakkelijker te detecteren. Omdat de meeste geautomatiseerde microscopen automatisch kan omgaan met een groot aantal platen, er praktisch geen beperkingen aan het aantal mutanten die tegelijkertijd kunnen worden gescreend. Afhankelijk van de pathogeen, de gebruiker privilege het gebruik van een epifluorescentie of confocale microscoop. Het tijdstip van beeldacquisitie zal vooral afhangen van de gevoeligheid van de microscoop camera, het aantal verworven per putje en het aantal kanalen verworven per veld gebieden. De gebruiker kan bepalen hoe deze factoren aan te passen aan de screening protocol te optimaliseren. Als voorbeeld, we imaged een 96-putjesplaat / hr met behulp van de onder 5.1 omstandigheden. Beeldanalyse grotendeels afhankelijk van de machine (of cluster van machines) gebruikt. We maken gebruik van een 12-kern (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM werkstation. Deze machine vereist onderlingeveer 40 min tot beelden die van de ene plaat te analyseren. Een belangrijk aspect waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwikkelen van deze assays is het opzetten van een nieuw (of het optimaliseren van bestaande) protocollen voor het manipuleren en verwerken van een groot aantal monsters mogelijk. Een kenmerkend voorbeeld is de ontwikkeling van de enkelvoudige primer kolonie-PCR benadering, waardoor we snel amplificeren sequentie en Coxiella DNA fragmenten die de plaats van invoeging van elk transposon, van zeer kleine monsters. Op basis van onze ervaring, de high-fidelity polymerase moet zorgvuldig worden geselecteerd en getest om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De enige beperking van deze benadering kan verbergen in de waarneming dat, in de meeste gevallen ongeveer 30% van de verwerkte monsters geen misbruik, hetzij als gevolg van de PCR of sequentiebepaling stappen. Echter, gezien het feit dat de isolatie van nieuwe Coxiella transposon mutanten is geen snelheidsbeperkende stap, betekent dit niet vertegenstuurde een groot probleem. Evenzo heeft het ontwikkelen van een betrouwbare bepaling om de bacteriële concentratie van mutant bestanden kwantificeren pijl op deze aanpak. Vanwege de neiging van Coxiella om te aggregeren wanneer in suspensie is het gebruik van optische dichtheid niet geldt voor de concentratie van Coxiella culturen en de enige bestaande alternatief was kwantitatieve PCR (qPCR) berekenen. Hier is het gebruik van een fluorescent gelabeld DNA intercalatiemiddel aanzienlijk versneld bacteriën kwantificering. Deze benadering kan ook gebruik maken van het gebruik van stabiele cellijnen die fluorescente merkers voor verschillende intracellulaire compartimenten naargelang het pathogeen gebruikt. Een ander belangrijk aspect is de toepassing van celkweekmedium zonder fenolrood. We vonden dat deze pH indicator een natuurlijke fluorescentie verspreid over de rode en groene spectrum dat het signaal dat op de geautomatiseerde fluorescentielezer verzadigd. THij strategie hier gepresenteerde berust op willekeurige transposon mutagenese. Voor de mutanten van belang, raden wij valideren unieke omzettingen (en klonaliteit) met behulp van Southern blot en PCR amplificaties van de transposon inbrengplaats. Naast de in de sectie protocol beschreven apparatuur, teams die geïnteresseerd zijn in het gebruik van de screening aanpak hier wordt gepresenteerd, zal groot voordeel in de set-up van een relationele database voor het verzamelen van gegevens, een server voor data-opslag en een werkstation voor snelle beeldanalyse. Belangrijk is dat de werkwijze die hier beschreven is geschikt voor de studie van andere intracellulaire bacteriële pathogenen verschaft een random mutagenese methode bestaat voor het pathogeen, kunnen cellijnen geïnfecteerd met het pathogeen en deze toont een specifiek fenotype tijdens infectie.

De opkomende, endemische bacterie Coxiella burnetii is verantwoordelijk voor grote uitbraken van Q-koorts, een slopende griepachtige zoönose met ernstige gezondheids- en economische impact 1. De belangrijkste reservoirs van Coxiella zijn huisdieren en vee, en er wordt geschat dat meer dan 90% van melkvee in de VS dragen C. burnetii 2. Mensen zijn toevallige hosts die geïnfecteerd zijn door inademing van besmette aerosolen. Human Q-koorts manifesteert ofwel als een acute of chronische ziekte, die fatale complicaties met een sterftecijfer bereiken van 65% 1,3 kan hebben. Met een besmettelijke dosis van 1-10 organismen, Coxiella de meest infectieuze pathogenen bekend en is onderzocht als een mogelijke biologisch wapen 4. De recente explosieve uitbraak van Q-koorts in Nederland (2007 - 2010), met cases dosis verhoogd wordt van 182 tot meer dan 2000 per jaar, is een voorbeeld van de zware virulentie van het pathogeen5. De opmerkelijke efficiëntie van Coxiella infecties is waarschijnlijk geassocieerd met resistentie tegen omgevingsstress, gecombineerd met zijn unieke aanpassing aan gastheercellen. Inderdaad, Coxiella aanwezig in het milieu in de vorm van metabolisch inactieve kleincellige varianten (SCV), die opmerkelijk resistent tegen meerdere zware omstandigheden (uitdroging, temperatuur, etc.). SCVs worden opgenomen door fagocytische cellen via α β V 3 integrinen 6 terwijl invasie van niet-fagocytische cellen wordt gemedieerd door de Coxiella adhesie / invasie OmpA 7 en een ongeïdentificeerde receptor. Na opname, Coxiella woont in nauwsluitende vacuoles, positief voor de vroege endosomale markers Rab5 en EEA1 8. Bacteriën reageren op endosomale verzuring door het omzetten naar metabolisch actief grote cel varianten (lichte bedrijfswagens) en het activeren van een Dot / Icm type 4 secretie systeem (T4SS) 9, Sterk homoloog is met die van Legionella pneumophila 10. De afscheiding van Dot / Icm effectoren laten Coxiella tot een grote, LAMP1-positieve zure compartiment met actieve lysosomale enzymen, waar bacteriën kunnen gedijen en actief te beschermen geïnfecteerde cellen van apoptose 11 genereren. Derhalve wordt de intracellulaire cyclus van Coxiella bestuurd door Dot / Icm-gemedieerde translocatie van bacteriële effectoren 12 echter de microbiële factoren betrokken bij gastheercel invasie, bacteriële replicatie en verspreiding van de infectie blijven grotendeels onbekend. De combinatie transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays ontwikkelen wij onpartijdige benaderingen voor de gelijktijdige identificatie van bacteriële factoren die bij de hoofdstappen van Coxiella infecties: 1) internalisatie in gastheercellen, 2) intracellulaire replicatie, 3) cell-to-cell spread en 4) de persistentie. Tot op heden hebben we meer dan 1.000 m afgeschermdutations in 500 Coxiella coderende sequenties, die ons met ongekende inzichten in de gastheer-pathogeen interacties die Coxiella pathogenese 7 reguleren. We merken kan deze benadering worden toegepast voor de studie van andere intracellulaire pathogenen die celbiologie elementen met Coxiella delen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasie en kolonisatie van gastheercellen door bacteriële pathogenen afhangen van de activiteit van een groot aantal prokaryotische eiwitten, gedefinieerd als virulentiefactoren die kan ondermijnen en manipuleren belangrijkste gastheerfuncties. De studie host / pathogen interactions is daarom van groot belang om bacteriële infecties te begrijpen en alternatieve strategieën om infectieziekten bestrijden. Deze benadering vereist echter de ontwikkeling van nieuwe high-throughput assays voor de onbevooroordeelde, geautomatiseerde identificatie en karakterisering van bacteriële virulentie determinanten. Hier beschrijven we een werkwijze voor het genereren van een GFP-gelabeld mutantbibliotheek door transposon mutagenese en de ontwikkeling van high content benaderingen voor de gelijktijdige identificatie van verschillende transposon-geassocieerde fenotypes. Ons werkmodel is de intracellulaire bacteriële pathogenen Coxiella burnetii, het etiologische agens van de zoönose Q-koorts, die wordt geassocieerd met SEvere uitbraken met een daaruit voortvloeiende gezondheid en economische last. De obligate intracellulaire karakter van deze pathogeen tot voor kort aanzienlijk bemoeilijkt de identificatie van bacteriële factoren betrokken bij ontvangst pathogen interactions, waardoor van Coxiella het ideale model voor de uitvoering van high-throughput / high content benaderingen.

Na isolatie van transposon mutanten enkele primer kolonie-PCR is een robuuste, high-throughput werkwijze voor de plaats van transposon insertie zijn voor elke mutant. Deze aanpak haalt uit een typische geneste PCR-protocol maar hier één primer hybridiseert specifiek en / of niet-specifiek aan het matrijs-DNA afhankelijk van de stringentie van de annealing temperatuur (figuur 1A). De typische PCR producten uit meerdere DNA-fragmenten, waarvan de meeste specifieke (Figuur 1B). Het gebruik van een andere sequentie primer die direct stroomopwaarts van het transposon ITR en stroomafwaarts van de sequentie die door de amplificatie primer hybridiseert verschaft specificiteit voor de sequentiestap (figuur 1C). Geautomatiseerde software voor sequentieanalyse lijnt de verkregen sequenties de Coxiella genoom die de juiste ligging van transposon inserties (figuur 1C). Alle transposon inserties kan dan annotated de Coxiella genoom (figuur 1D). Elke Coxiella mutant geïsoleerd en geamplificeerd in axenisch ACCM-2 medium voordat hetzij opslag of screening. Figuur 2 toont een voorbeeld van 38 transposon mutanten in 16 dot / icm Coxiella genen (Figuur 2A). Om de levensvatbaarheid van Coxiella mutanten te beoordelen, wordt axenic groeicurven verkregen door bemonstering bacterieculturen gedurende 7 dagen na inoculatie en toepassen van de bacteriële concentratie assay 1,5 (Figurie 2B) beschreven. Versterkte mutanten worden vervolgens geïncubeerd met epitheelcellen in drievoud 96-well platen gedurende 7 dagen. Alle Coxiella mutanten gegenereerd worden GFP-gelabeld, intracellulaire groeicurven worden verkregen door meting van de fluorescentie-intensiteit van GFP per put, elke 24 uur, en het uitzetten van de gemeten waarden als functie van de tijd (Figuur 2C). Intracellulair groeicurven bieden kwantitatieve analyse van de fenotypen geassocieerd met elke transposon insertie in het genoom Coxiella. Om kwalitatieve informatie toe te voegen ongeveer hetzelfde transposon mutanten, hebben we gekozen voor geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse. Zeven dagen na infectie platen gefixeerd, verwerkt voor immunofluorescentie zoals beschreven in 4 en toepassing van een geautomatiseerde, epifluorescentiemicroscoop zoals beschreven in 5. Geautomatiseerde beeldanalyse software zoals CellProfiler (Broad Institute, geanalyseerd <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) verwerkt de verkregen kanalen onafhankelijk en segmenten geïdentificeerd objecten vergelijkende analyse (Figuur 3). Dit maakt de identificatie en morfologische karakterisering van gastheer celkernen, cel contouren, lysosomen en Coxiella kolonies (Figuur 3 bovenste panelen). Correleren Coxiella kolonies met cellen en lysosomen kan de identificatiop en specifieke morfologische analyse van Coxiella bevattende vacuolen (die LAMP1 positief, Figuur 3 linksonder paneel). Correleren Coxiella kolonies met gastheercel contouren maakt de identificatie en specifieke morfologische analyse van geïnfecteerde cellen (figuur 3 onderaan in het midden paneel). Tenslotte worden de 4 kanalen samengevoegd ter illustratie en kwaliteitscontrole (figuur 3 rechterbenedenhoek). De gegevens verkregen uit geautomatiseerde beeldanalyse kunnen tegen elkaar worden uitgezet om &quot;multi-fenotypische puntgrafieken&quot; te verkrijgen. Als voorbeeld, in figuur 4A de gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies uitgezet tegen het aantal kolonies per cel (Figuur 4A), teneinde mutaties die intracellulaire replicatie van Coxiella (replicatie fenotype) en / of van invloed identificeren de capaciteit van de bacteriën om gastheercellen binnenvallen (internabiliseren fenotype). Statistische analyse werd gebruikt om de regio&#39;s in de resulterende puntgrafiek overeenkomt met milde (-4 &lt;Z-score ≤ -2) en ernstige (Z-score ≤ -4) fenotypes definiëren. Mutanten werden waargenomen bij 3 hoofdclusters: mutaties die resulteren in een gebrekkige intracellulaire groei van Coxiella werden gegroepeerd in de meest linkse gedeelte van de grafiek (Figuur 4A, roze en rode stippen); mutaties die Coxiella internalisatie in cellen beïnvloed werden gegroepeerd in het onderste gedeelte van de grafiek (Figuur 4A, licht en donker blauwe stippen) en tenslotte, groene stippen in de meest rechtse gebied van het perceel corresponderen met mutaties resulteren in niet-significante fenotypen ( Z-score&gt; -2). Belangrijk mutanten die niet te repliceren, maar nog kunnen gastheercellen binnendringen, worden gedetecteerd na 7 dagen na infectie als enkele bacterie of kleine kolonies, naast celkernen (Figuur 4C, tweede paneel) systeem. Vandaar dat de grootte van Coxiella &quot;colonies &quot;aanzienlijk worden beïnvloed maar het aantal geïnfecteerde cellen wordt niet beïnvloed in vergelijking met WT Coxiella geïnfecteerde cellen. Integendeel, mutaties die het vermogen van Coxiella gastheercellen binnendringen beïnvloeden resulteren in een afname in het aantal kolonies / cel. Is dit aantal ver onder 1, betekent dit dat, gemiddeld, is er een afname van het aantal geïnfecteerde cellen. Als alternatief kan de gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies tegen het aantal gastheercellen dat infectie (figuur 4B), wordt uitgezet mutaties die cytotoxiciteit voor Coxiella (cytotoxische fenotype) verlenen identificeren. Zoals hierboven, werd een statistische analyse gebruikt om de regio&#39;s in de resulterende puntgrafiek overeenkomt met milde (-4 &lt;Z-score ≤ -2) en ernstige (Z-score ≤ -4) fenotypes definiëren. Het meest afgeschermde mutaties hadden geen significant effect celoverleving, ongeacht bacteriële replicatie in gastheercellen (Figuur 3B groene stippen). 37 mutaties mild aangetaste gastheercel overleving (figuur 3B, licht rode stippen), en 7 mutaties waren bijzonder schadelijk voor het hosten van de cel overleving (figuur 3B, donker rode stippen). Let op: er parameters verkregen door geautomatiseerde beeldanalyse procedure kan worden gebruikt om andere overzichten afleiden Volgens experimentele behoeften. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figuur 1:. Sequentiebepaling en annotatie van Coxiella transposon mutanten (A) Single kolonie PCR primer wordt gebruikt om DNA fragmenten die de plaats van transposon insertie amplificeren. Een amplificatieprimer (Amp) wordt gebruikt als een specifieke en niet-specifieke primer, afhankelijk van de stringentie van de hybridisatie temperatuur. (B) Typisch resultaat van enkele primer kolonie PCR. Elke reactiOp produceert een aantal fragmenten van variabele grootte, waarvan sommige het transposon insertie site; anderen worden willekeurig geamplificeerd als bijproducten van de lage stringentie PCR-cyclus. (C) Het gebruik van een primer sequentie (Seq) dat hybridiseert met het transposon functie kan de volgorde van de fragmenten van belang. (D) Sequentieanalyse software laat de automatische annotatie van transposon toevoegingen op het bacteriële genoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figuur 2:. Axenische en intracellulaire groei van Coxiella transposon mutanten (A) In de pilot scherm, hebben we geïsoleerd, gesequenced en gescreend 38 transposon mutanten kern 16 genes van de Coxiella dot / icm secretie systeem (aangegeven in rood). (B) Teneinde de levensvatbaarheid van elk transposon mutant te beoordelen, de groei van elk isolaat in axenische kweekmedium wordt gevolgd gedurende 8 dagen onder toepassing van een fluorescent gelabeld DNA intercalatiemiddel. (C) Elke mutant wordt vervolgens gebruikt om epitheelcellen te infecteren. Omdat de transposon bezit een GFP cassette, wordt de intracellulaire groei van bacteriën dan 7 dagen van de infectie gecontroleerd door de variaties van GFP fluorescentie geassocieerd met Coxiella replicatie, met behulp van een microplaat reader. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figuur 3: Geautomatiseerde beeldanalyse van Coxiella infecties Een auto.Gekoppelde epifluorescentie microscoop wordt gebruikt om de afbeelding 21 posities per putje van 96 triplo-putjes. Het beeld analyse software segmenten objecten in elke verworven kanalen voor kwantificering en analyse. In alle gevallen worden de voorwerpen rand van de beelden raken uitgesloten. (A) De Hoechst kanaal wordt gebruikt om gastheercellen te identificeren kernen (omcirkeld in groen). (B) Deze worden gebruikt als zaden gastheercel contouren in het Cy3 kanaal te identificeren (de positie van de kernen wordt omcirkeld in blauw, cel contouren zijn in het groen). (C) De Cy5 kanaal wordt gebruikt om LAMP1-positieve compartimenten te identificeren (omcirkeld in groen); alleen de objecten opgenomen in de eerder geïdentificeerde cel contouren (in het rood) worden bewaard voor beeldanalyse. (D) De GFP-kanaal wordt gebruikt om Coxiella kolonies te identificeren (omcirkeld in groen). (E) Correleren Coxiella kolonies met LAMP1-positieve compartimenten maakt de identificatie van Coxiella </em&gt; Bevattende vacuolen (CCV); alleen de objecten opgenomen in de eerder geïdentificeerde cel contouren (in het groen) worden bewaard voor beeldanalyse. (F) Correleren Coxiella kolonies met mobiele contouren maakt de identificatie van geïnfecteerde cellen (pseudocolored). (G) beelden die in de 4 fluorescentie kanalen (corresponderend met Coxiella kolonies (groen) talrijke celkernen (blauw), de gastheercel plasmamembraan (grijs), LAMP1-positief compartimenten (red)) worden samengevoegd en gebruikt voor illustratie en kwaliteit control. Schaal bars 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figuur 4: Grootschalige identificatie van Coxiella factoren betrokken bij gastheer / ziekteverwekker interactionen. (A) De gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies uitgezet tegen het relatieve aantal kolonies per cel replicatie en internalisatie fenotypen van belang te identificeren. Groene stippen vertegenwoordigen fenotypes die afwijken van WT Coxiella door een Z-score&gt; -2 (niet significant). Roze en licht blauwe stippen vertegenwoordigen replicatie en internalisatie fenotypes respectievelijk met een Z-score tussen -2 en -4 (mild fenotypes). Rode en donker blauwe stippen vertegenwoordigen fenotypes met een Z-score ≤ -4 (sterke fenotypes). (B) De gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies werd uitgezet tegen het aantal cellen (geïnfecteerd en niet geïnfecteerd) die 7 dagen na infectie overleefden het schatten van de cytotoxische werking voortvloeiende uit transposon inserties. Groene stippen vertegenwoordigen fenotypes die afwijken van WT Coxiella door een Z-score&gt; -2 (niet significant). Roze stippen vertegenwoordigen cytotoxische phenotypes met een Z-score tussen -2 en -4 (mild fenotypes). Rode stippen vertegenwoordigen cytotoxische fenotypes met een Z-score ≤ -4 (sterke fenotypes). Pijlen geven mutanten blijkt uit de overeenkomstige kleine letter C. (C) Representatieve beelden van replicatie, internalisatie en cytotoxische fenotypes. In alle gevallen gastheercel kernen in rood, Coxiella kolonies in groen. Schaal bars 50 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Faciliteren Drug Discovery: een geautomatiseerde high-content Ontsteking Assay in de zebravis

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Het gebruik van mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner transposon-gemedieerde mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput parallelle Sequencing maatregel fitness van Leptospira interrogans Transposon invoeging mutanten tijdens Golden Syrische Hamster infectie

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replicatie van de besteld, Nonredundant bibliotheek van Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon insertiemutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...