Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

L&#39;étude des interactions hôte / pathogène a prouvé être une méthode remarquable pour comprendre les infections bactériennes et développer des stratégies alternatives pour contrer les maladies infectieuses. Toutefois, en raison de la diversité des stratégies élaborées par différents pathogènes bactériens, l&#39;identification et la caractérisation des facteurs de virulence bactériens et des voies de signalisation hôte qui sont ciblés au cours des infections représentent un véritable défi. Cela nécessite le développement de nouvelles approches pour l&#39;identification à grande échelle des principaux hubs d&#39;interaction hôte / pathogène. Le développement récent de, à haut débit innovantes et des techniques de criblage à haut contenu représente une ressource inestimable qui peut être adapté à l&#39;étude des bactéries pathogènes intracellulaires 15. Ici, nous avons utilisé la zoonose bactérienne pathogène Coxiella burnetii comme un modèle à développer des approches de dépistage qui combinent mutagenèse de transposon et des essais basés sur la fluorescence. Importantly, cette méthode de dépistage permet la surveillance simultanée de plusieurs étapes du cycle intracellulaire Coxiella, fournissant un aperçu global des stratégies développées par cette bactérie d&#39;envahir, de reproduire et de persister dans les cellules infectées. L&#39;approche décrite ici est basée sur deux techniques bien établies, la mutagenèse de transposon et des essais basés sur la fluorescence, qui ont été appliquées avec succès à l&#39;étude des agents pathogènes bactériens. La combinaison de ces techniques dans le contexte des écrans à haut débit / haute contenu nous permet d&#39;évaluer les effets d&#39;un nombre élevé de mutations bactériennes en analysant un nombre très élevé d&#39;événements (typiquement 15 000 cellules infectées par des mutations bactériennes sont imagées et analysées). Ceci fournit une analyse statistique importante d&#39;événements tels que l&#39;invasion bactérienne des cellules hôtes et la réplication intracellulaire, qui sont, par nature, soumises à une forte variabilité. Il est important de noter que les lignées cellulaires autres que epithelial peuvent être utilisés pour ce type de dépistage. Toutefois, les cellules epitheliales plates et larges sont optimales pour l&#39;analyse d&#39;images comme des organelles de cellules hôtes sont plus faciles à détecter. Parce que la majorité des microscopes automatisés peut traiter automatiquement un grand nombre de plaques, il n&#39;y a pratiquement pas de limites au nombre de mutants qui peut être projeté simultanément. En fonction de l&#39;agent pathogène, l&#39;utilisateur peut privilégier l&#39;utilisation d&#39;une épifluorescence ou un microscope confocal. Le moment de l&#39;acquisition de l&#39;image est essentiellement dépendre de la sensibilité de la caméra du microscope, sur le nombre de champs par puits et acquises sur le nombre de canaux acquises par le champ de vision. L&#39;utilisateur peut décider comment ajuster ces facteurs pour optimiser le protocole de dépistage. A titre d&#39;exemple, nous imager une plaque de 96 puits / h en utilisant les conditions indiquées au point 5.1. L&#39;analyse d&#39;images dépend largement de la machine (ou groupe de machines) utilisé. Nous utilisons un 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 Go de RAM poste de travail. Cette machine nécessite environ 40 min pour analyser les images acquises d&#39;une plaque. Un aspect important à prendre en compte lors de l&#39;élaboration de ces tests est la mise en place de la nouvelle (ou l&#39;optimisation des protocoles existants) pour permettre la manipulation et le traitement d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons. Un exemple typique est le développement de l&#39;approche PCR de l&#39;amorce de colonie unique, qui nous a permis d&#39;amplifier rapidement et fragments séquence Coxiella ADN contenant le site d&#39;insertion du transposon chaque, à partir de très petits échantillons. Basé sur notre expérience, la polymérase haute fidélité doit être soigneusement sélectionnés et testés afin d&#39;obtenir des résultats reproductibles. La seule limitation de cette approche peut se cacher dans l&#39;observation que, dans la majorité des cas, environ 30% des échantillons traités ne sont pas exploitables, soit en raison de la PCR ou les étapes de séquençage. Cependant, étant donné que l&#39;isolement des nouveaux mutants de transposons Coxiella est pas une étape de limitation de vitesse, cela ne repré pasenvoyé un enjeu majeur. De même, le développement d&#39;un test fiable de quantifier la concentration bactérienne des stocks mutantes a été la clé de cette approche. En raison de la tendance de Coxiella d&#39;agréger quand en suspension, l&#39;utilisation des lectures de densité optique est pas applicable pour le calcul de la concentration de cultures Coxiella et la seule alternative existante était PCR quantitative (qPCR). Ici, l&#39;utilisation d&#39;un agent intercalant d&#39;ADN marqués par fluorescence significativement accélérer la quantification des bactéries. Cette approche peut également profiter de l&#39;utilisation de lignées cellulaires stables exprimant des marqueurs fluorescents pour plusieurs compartiments intracellulaires selon l&#39;agent pathogène utilisé. Un autre aspect important est l&#39;utilisation de milieux de culture cellulaire dépourvu de rouge de phénol. Nous avons constaté que cet indicateur de pH a une fluorescence naturelle couvrant le spectre rouge et vert qui sature le signal enregistré sur le lecteur de fluorescence automatisé. Ta stratégie présentée ici repose sur la mutagenèse aléatoire transposon. Pour les mutants d&#39;intérêt, nous vous recommandons de valider transpositions uniques (et clonalité) en utilisant transfert de Southern et amplifications PCR du site d&#39;insertion du transposon. Outre l&#39;équipement décrit dans la section de protocole, équipes intéressées à l&#39;aide de l&#39;approche de dépistage présenté ici, auront grand avantage dans la mise en place d&#39;une base de données relationnelle pour la collecte de données, un serveur pour le stockage des données et une station de travail pour l&#39;analyse rapide des images. Fait important, le procédé décrit ici est approprié pour l&#39;étude d&#39;autres agents pathogènes bactériens intracellulaires fourni un procédé de mutagenèse aléatoire existe pour l&#39;agent pathogène, des lignées de cellules peuvent être infectées par l&#39;agent pathogène et celui-ci affiche un phénotype spécifique au cours de l&#39;infection.

La bactérie Coxiella burnetii émergente endémique est responsable de grandes épidémies de fièvre Q, une zoonose débilitante pseudo-grippal avec la santé et l&#39;impact économique grave 1. Les principaux réservoirs de Coxiella sont des animaux domestiques et d&#39;élevage, et on estime que plus de 90% des bovins laitiers aux États-Unis portent C. burnetii 2. Les humains sont des hôtes accidentels qui sont infectés par inhalation d&#39;aérosols contaminés. La fièvre Q humaine manifeste soit comme une maladie aiguë ou chronique, qui peut avoir des complications mortelles avec un taux de mortalité atteignant 65% 1,3. Avec une dose infectieuse de 1 - 10 organismes, Coxiella est le pathogène le plus infectieux connu et il a été étudié comme un bio arme potentielle 4. L&#39;épidémie récente de explosive fièvre Q aux Pays-Bas (2007 - 2010), avec des cas escalade de 182 à plus de 2000 par an, est un exemple de la virulence de cet agent pathogène grave5. L&#39;efficacité remarquable des infections Coxiella est probablement associée à sa résistance au stress environnemental, combiné avec son adaptation unique de cellules hôtes. En effet, Coxiella est présent dans l&#39;environnement sous forme de variantes métaboliquement inactifs à petites cellules (SCV), qui sont remarquablement résistante à plusieurs conditions difficiles (dessiccation, température, etc.). VCS sont absorbé par des cellules phagocytaires via α V β 3 intégrines 6 tandis que l&#39;invasion des cellules non-phagocytaires est médiée par la Coxiella adhérence / invasion OmpA 7 et un récepteur non encore identifié. Après absorption, Coxiella réside dans les vacuoles moulants, positifs pour les marqueurs endosomes précoces et Rab5 EEA1 8. Les bactéries répondent aux acidification endosomique en convertissant des variantes de cellules grandes métaboliquement actifs (VUL) et l&#39;activation d&#39;un type 4 système de sécrétion Dot / Icm (T4SS) 9, Fortement homologue à celle de 10 Legionella pneumophila. La sécrétion d&#39;effecteurs Dot / ICM permet Coxiella pour générer un grand compartiment acide, LAMP1 positif contenant des enzymes lysosomales actifs où les bactéries peuvent se développer et protéger activement les cellules infectées de l&#39;apoptose 11. Par conséquent, le cycle intracellulaire de Coxiella est contrôlée par la translocation Dot / Icm d&#39;effecteurs à médiation par 12 bactériennes, cependant, les facteurs impliqués dans l&#39;invasion microbienne de la cellule hôte, la replication bactérienne et la diffusion de l&#39;infection restent en grande partie inconnus. Combinant mutagenèse de transposon et des essais basés sur la fluorescence, nous développons des approches impartiales pour l&#39;identification simultanée de facteurs bactériens impliqués dans les principales étapes d&#39;infections Coxiella: 1) l&#39;internalisation dans les cellules hôtes, 2) la réplication intracellulaire, 3) la propagation de cellule à cellule et 4) la persistance. À ce jour, nous avons passé au crible plus de 1000 mutations dans 500 séquences codantes Coxiella, qui nous ont fourni des perspectives sans précédent dans les interactions hôte-pathogène qui régulent Coxiella pathogenèse 7. Fait à noter, cette approche peut être appliquée à l&#39;étude d&#39;autres pathogènes intracellulaires qui partagent des caractéristiques de biologie cellulaire avec Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion et la colonisation des cellules hôtes de bactéries pathogènes dépendent de l&#39;activité d&#39;un grand nombre de protéines procaryotes, défini comme étant des facteurs de virulence, qui peut renverser et manipuler des fonctions essentielles de l&#39;hôte. L&#39;étude des interactions hôte / pathogène est donc extrêmement important de comprendre les infections bactériennes et développer des stratégies alternatives pour contrer les maladies infectieuses. Cependant, cette approche nécessite le développement de nouveaux tests à haut débit pour la impartiale, l&#39;identification automatisée et la caractérisation des facteurs de virulence bactériens. Ici, nous décrivons un procédé pour la production d&#39;une banque de mutants GFP-étiqueté par mutagenèse par transposon et le développement d&#39;un criblage à haut contenu approches pour l&#39;identification simultanée de plusieurs phénotypes de transposon associé. Notre modèle de travail est le bactérienne pathogène Coxiella burnetii intracellulaire, l&#39;agent étiologique de la fièvre Q zoonose, qui est associé à soivere les épidémies de la santé avec une conséquente et le fardeau économique. La nature intracellulaire obligatoire de cet agent pathogène a, jusqu&#39;à récemment, gravement entravé l&#39;identification des facteurs bactériens impliqués dans les interactions hôte-pathogène, faisant de Coxiella le modèle idéal pour la mise en œuvre d&#39;approches à haut débit / haute-contenu.

Après isolement de mutants de transposons, colonie unique d&#39;amorces de PCR est une méthode à haut débit robuste pour identifier le site d&#39;insertion du transposon pour chaque mutant. Cette approche découle d&#39;un protocole typique PCR nichée, mais ici une seule amorce hybridant spécifiquement et / ou de manière non spécifique à l&#39;ADN de matrice en fonction de la stringence de la température de recuit (figure 1A). Les produits de PCR typiques sont constitués de multiples fragments d&#39;ADN, dont la plupart sont spécifiques (figure 1B). L&#39;utilisation d&#39;une amorce de séquençage différent qui apparie droit en amont de l&#39;ITR du transposon, et en aval de la séquence reconnue par l&#39;amorce d&#39;amplification fournit une spécificité pour l&#39;étape de mise en séquence (figure 1C). Logiciel automatisé pour l&#39;analyse de séquence permet d&#39;aligner les séquences obtenues dans le génome de Coxiella fournir l&#39;emplacement exact des insertions de transposons (figure 1c). Toutes les insertions de transposons peuvent être ensuite annotated sur le génome de Coxiella (Figure 1D). Chaque mutant Coxiella est isolé et amplifié dans des conditions axéniques-2 ACCM milieu soit avant le stockage ou le criblage. La figure 2 illustre un exemple de mutants de transposons 38 à 16 points / ICM Coxiella gènes (figure 2A). Pour évaluer la viabilité des mutants Coxiella, courbes de croissance axéniques sont obtenues par échantillonnage cultures bactériennes pendant 7 jours après l&#39;inoculation et l&#39;application de l&#39;analyse de la concentration bactérienne décrit dans 1.5 (Figurie 2B). Mutants amplifiés sont ensuite incubées avec les cellules épithéliales, en triplicata plaques de 96 puits pendant 7 jours. Tous les mutants générés étant Coxiella GFP-étiqueté, les courbes de croissance intracellulaires sont obtenus en mesurant l&#39;intensité de fluorescence de la GFP de chaque puits, chaque 24 h, et ​​le tracé des valeurs mesurées en fonction du temps (figure 2C). Intrles courbes de croissance acellulaires fournissent une analyse quantitative des phénotypes associés à chaque insertion de transposon dans le génome de Coxiella. Pour ajouter des informations qualitatives sur les mêmes mutants de transposons, nous avons opté pour l&#39;acquisition d&#39;image automatisé et d&#39;analyse. Sept jours après l&#39;infection, les plaques sont fixées, traitées pour immunofluorescence comme décrit à 4 et analysés en utilisant un système automatisé, tel que décrit microscope à épifluorescence en 5. logiciel d&#39;analyse d&#39;image automatisée comme CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) traite les canaux acquis et indépendamment des segments identifiés des objets d&#39;analyse comparative (figure 3). Ceci permet l&#39;identification et la caractérisation morphologique des noyaux de cellules hôtes, des contours de cellules, des lysosomes et Coxiella colonies (figure 3 panneaux supérieurs). Corréler colonies Coxiella avec les cellules et permet aux lysosomes identificatiet une analyse morphologique spécifique de vacuoles contenant Coxiella (qui sont LAMP1 positif, Figure 3 du panneau en bas à gauche). Corréler colonies Coxiella avec des contours de la cellule hôte permet l&#39;identification et l&#39;analyse morphologique spécifique des cellules infectées (Figure 3 en bas du panneau de centre). Enfin, les 4 canaux sont fusionnés pour l&#39;illustration et à des fins de contrôle de qualité (Figure 3 du panneau en bas à droite). Les données obtenues par analyse d&#39;image automatisée peuvent être tracées uns contre les autres pour obtenir des «nuages ​​de points multi-phénotypiques&quot;. A titre d&#39;exemple, sur la figure 4A la superficie moyenne (en um 2) de colonies Coxiella est tracée en fonction du nombre de colonies par cellule (figure 4a), afin d&#39;identifier des mutations qui affectent la réplication intracellulaire de Coxiella (phénotype de replication) et / ou la capacité des bactéries d&#39;envahir les cellules hôtes (internalisation phénotype). L&#39;analyse statistique a été utilisé pour définir les régions dans le nuage de points résultant correspondant aux douces (-4 &lt;Z-score ≤ -2) et sévère (Z-score ≤ -4) phénotypes. Mutants ont été observés dans 3 pôles principaux: des mutations qui ont abouti à une croissance intracellulaire défectueux de Coxiella ont été regroupés dans la partie la plus à gauche de la parcelle (figure 4A, rose et points rouges); mutations qui ont affecté Coxiella internalisation dans les cellules ont été regroupés dans la partie inférieure de la parcelle (figure 4A, bleu clair et bleu foncé points) et enfin, des points verts dans la région la plus à droite de la parcelle correspondent aux mutations résultant de phénotypes non significatifs ( Z-score&gt; -2). Fait important, les mutants qui ne parviennent pas à se répliquer mais sont encore capables d&#39;envahir les cellules hôtes, sont détectés après 7 jours d&#39;infection que des bactéries ou des simples, de petites colonies, adjacentes à accueillir les noyaux des cellules (figure 4C, panneau secondes). Par conséquent, la taille de Coxiella &quot;coloentre- &quot;sera affectée de façon significative, mais le nombre de cellules infectées ne varie pas par rapport à des cellules infectées par le WT Coxiella. Au contraire, des mutations qui affectent la capacité de Coxiella à envahir les cellules hôtes se traduisent par une diminution du nombre de colonies / cellule. Lorsque ce nombre est nettement inférieur à 1, cela signifie que, en moyenne, on constate une diminution du nombre total de cellules infectées. En variante, la superficie moyenne (en um 2) de colonies Coxiella peut être tracée en fonction du nombre de cellules hôtes qui survivent infection (figure 4B), pour identifier les mutations qui confèrent une cytotoxicité à Coxiella (phénotype cytotoxique). Comme ci-dessus, l&#39;analyse statistique a été utilisé pour définir les régions dans le nuage de points résultant correspondant aux douces (-4 &lt;Z-score ≤ -2) et sévère (Z-score ≤ -4) phénotypes. La plupart des mutations dépistage n&#39;a pas affecté de façon significative la survie des cellules, indépendamment de la réplication bactérienne dans hôtecellules (figure 3B points verts). 37 mutations survie de la cellule hôte légèrement affectée (figure 3B, les points rouges légers), et 7 mutations étaient particulièrement préjudiciable pour accueillir la survie des cellules (figure 3B, points rouges sombres). S&#39;il vous plaît noter que les paramètres supplémentaires obtenus par l&#39;image procédure d&#39;analyse automatisé peuvent être utilisés pour tirer d&#39;autres cartes, en fonction des besoins expérimentaux. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figure 1:. Séquençage et annotation de mutants de transposon Coxiella (A) à l&#39;unité primaire colonie PCR est utilisée pour amplifier des fragments d&#39;ADN contenant le site d&#39;insertion du transposon. Une amorce d&#39;amplification (Amp) est utilisé à la fois comme amorce spécifique et non-spécifique en fonction de la stringence de la température de recuit. (B) de résultat typique de colonie seule amorce PCR. Chaque Reactile produit un certain nombre de fragments de taille variable, dont certaines contiennent le site d&#39;insertion du transposon; certains autres sont amplifiés de manière aléatoire en tant que sous-produits du cycle de PCR à faible stringence. (C) L&#39;utilisation d&#39;une amorce de séquençage (SEQ) qui hybride à la séquence du transposon permet le séquençage des fragments d&#39;intérêt. Logiciel (D) d&#39;analyse de séquence permet l&#39;annotation automatique des insertions de transposons sur le génome bactérien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figure 2:. Axénique et la croissance intracellulaire de mutants de transposons Coxiella (A) Dans l&#39;écran de pilote, nous avons isolé, séquencé et projeté 38 mutants de transposons dans 16 g de baseEnes du système dot / ICM sécrétion Coxiella (indiqués en rouge). (B) Afin d&#39;évaluer la viabilité de chaque mutant de transposon, la croissance de chaque isoler dans un milieu de culture axénique est surveillé de plus de 8 jours à l&#39;aide d&#39;un agent de fluorescence taggés intercalant d&#39;ADN. (C) Pour chaque mutant est ensuite utilisé pour infecter des cellules épithéliales. Comme le transposon possède une cassette de la GFP, la croissance bactérienne intracellulaire est surveillé de plus de 7 jours de l&#39;infection en suivant les variations de fluorescence de la GFP associé à la réplication Coxiella, en utilisant un lecteur de microplaques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figure 3: analyse d&#39;image automatisée des infections Coxiella Une auto.accouplée microscope à épifluorescence est utilisé pour l&#39;image 21 positions par puits en triple de plaques à 96 puits. Les segments de logiciels d&#39;analyse d&#39;images objets dans chaque canaux acquis pour la quantification et l&#39;analyse. Dans tous les cas, les objets touchant la frontière des images sont exclus. (A) Le canal Hoechst est utilisé pour identifier les noyaux des cellules de l&#39;hôte (entouré en vert). (B) Ceux-ci sont utilisés comme semences pour identifier les contours de la cellule hôte dans le canal Cy3 (la position des noyaux est entouré en bleu, les contours de cellules sont en vert). (C) Le canal Cy5 est utilisé pour identifier les compartiments de LAMPE1-positive (dans le cercle vert); seulement les objets inclus dans les contours de cellules identifiées précédemment (en rouge) sont retenus pour l&#39;analyse d&#39;image. (D) Le canal de la GFP est utilisé pour identifier les colonies de Coxiella (entouré en vert). (E) corrélation colonies Coxiella avec des compartiments de LAMPE1 positif permet l&#39;identification de Coxiella </em&gt; vacuoles contenant (CCVS); seulement les objets inclus dans les contours de cellules identifiées précédemment (en vert) sont retenus pour l&#39;analyse d&#39;image. (F) en corrélation avec des contours Coxiella colonies de cellules permet l&#39;identification de cellules infectées (de pseudocolored). (G) Les images acquises dans les 4 canaux de fluorescence (correspondant à colonies Coxiella (vert), des noyaux de la cellule hôte (bleu), la membrane de la cellule hôte plasma (gris), les compartiments de LAMPE1-positif (rouge)) sont fusionnés et utilisée pour l&#39;illustration et de la qualité contrôle. Échelle barres 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figure 4: l&#39;identification à grande échelle des facteurs impliqués dans Coxiella hôte / pathogène interagissentions. (A) Le Quartier moyenne (en pm 2) des colonies Coxiella est tracée contre le nombre relatif de colonies par cellule, afin d&#39;identifier et de réplication internalisation phénotypes d&#39;intérêt. Les points verts représentent phénotypes qui dévient de WT Coxiella par un Z-score&gt; -2 (non significatif). Points roses et bleu clair représentent réplication et de l&#39;internalisation des phénotypes respectivement, avec un Z-score entre -2 et -4 (phénotypes bénins). Points bleu foncé Rouge et représentent phénotypes avec un Z-score ≤ -4 (phénotypes forts). (B) La surface moyenne (en um 2) de Coxiella colonies a été tracée en fonction du nombre total de cellules (infectées et non infectées) qui ont survécu 7 jours suivant l&#39;infection pour estimer l&#39;effet cytotoxique résultant de la insertions de transposons. Les points verts représentent phénotypes qui dévient de WT Coxiella par un Z-score&gt; -2 (non significatif). Points roses représentent cytotoxique phenotypes avec un Z-score entre -2 et -4 (phénotypes bénins). Les points rouges représentent les phénotypes cytotoxiques avec un Z-score ≤ -4 (phénotypes forts). Les flèches indiquent mutants illustrés par la lettre minuscule correspondante de C (C) des images représentatives de la réplication, l&#39;internalisation et phénotypes cytotoxiques. Dans tous les cas, les noyaux de cellules hôtes sont en rouge, les colonies sont Coxiella en vert. Échelle barres 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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