Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Studie von Wirt / Pathogen-Interaktionen hat sich als bemerkenswert Verfahren, um bakterielle Infektionen zu verstehen und zu entwickeln alternative Strategien zur Infektionskrankheiten entgegenzuwirken. Aufgrund der Vielfalt der Strategien durch verschiedene bakterielle Erreger ausgearbeitet, die Identifizierung und Charakterisierung von bakteriellen Virulenzfaktoren und des Host-Signalwege, die bei Infektionen abzielen stellen jedoch eine echte Herausforderung. Dies erfordert die Entwicklung neuer Konzepte für die Groß Identifizierung von Schlüssel Wirt / Pathogen-Interaktion Hubs. Die jüngste Entwicklung von innovativen, Hochdurchsatz-und High-Content-Screening-Verfahren stellt eine wertvolle Ressource, die sich dem Studium der intrazelluläre bakterielle Erreger 15 angepasst werden kann. Hier haben wir die zoonotische bakteriellen Erreger Coxiella burnetii als Modell verwendet werden, um Screening-Ansätze, die Transposon-Mutagenese und fluoreszenzbasierte Tests zu kombinieren zu entwickeln. Importantly ermöglicht diese Screening-Verfahren die gleichzeitige Überwachung mehrerer Schritte des Coxiella intrazellulären Zyklus und bietet eine globale Übersicht über die durch dieses Bakterium entwickelt zu erobern, zu replizieren und bleiben in infizierten Zellen Strategien. Der hier beschriebene Ansatz basiert auf zwei etablierte Techniken, Transposon-Mutagenese und fluoreszenzbasierte Tests, die erfolgreich auf das Studium der bakteriellen Erreger angewendet wurden basierend. Die Kombination dieser Techniken, die in Zusammenhang mit der Hochdurchsatz / High-Content-Bildschirme ermöglicht es, die Auswirkungen einer Anzahl von Bakterien Mutationen durch die Analyse einer sehr hohen Anzahl von Ereignissen (typischerweise 15.000 infizierten Zellen pro Bakterien Mutationen werden abgebildet und analysiert) auszuwerten. Dies stellt eine wichtige statistische Analyse der Ereignisse, wie bakterielle Invasion von Wirtszellen und die intrazelluläre Replikation, die sind von Natur aus mit hoher Variabilität. Es ist wichtig zu beachten, dass Zelllinien mit Ausnahme epithelial können für diese Art von Screening verwendet werden. Allerdings sind flach und große Epithelzellen optimal für die Bildanalyse als Wirtszellorganellen sind leichter zu erkennen. Da die Mehrzahl der automatisierten Mikroskopen automatisch verarbeiten eine Vielzahl von Platten, gibt es praktisch keine Grenzen für die Anzahl von Mutanten, die gleichzeitig untersucht werden können. Abhängig von dem Pathogen, kann der Benutzer Berechtigung der Verwendung eines Epifluoreszenz oder einem konfokalen Mikroskop. Die Zeit der Bildaufnahme wird überwiegend abhängig von der Empfindlichkeit der Mikroskopkamera, auf die Anzahl der Felder pro Vertiefung und der Anzahl der Kanäle pro Sichtfeld erfasst erworben. Der Benutzer kann entscheiden, wie diese Faktoren anpassen, um die Screening-Protokoll zu optimieren. Als ein Beispiel abgebildet wir eine Platte mit 96 Vertiefungen / h unter Verwendung der in Punkt 5.1 genannten Bedingungen. Bildanalyse hängt weitgehend von der verwendeten Maschine (oder Gruppe von Maschinen). Wir verwenden eine 12-Core (2 x 3.06 GHz 6-Core), 48 GB RAM Workstation. Diese Maschine erfordert Angleirungsweise 40 Minuten, um Bilder von einer Platte erworben zu analysieren. Ein wichtiger Aspekt in Betracht gezogen werden, bei der Entwicklung dieser Assays ist die Menge von neuen (oder die Optimierung von bestehenden) Protokollen, um die Manipulation und Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben ermöglicht. Ein typisches Beispiel ist die Entwicklung der einzelnen Primer Kolonie-PCR-Ansatz, der uns schnell verstärken und erlaubt Sequenz Coxiella DNA-Fragmente, die die Stelle der Insertion jedes Transposon, aus sehr kleinen Proben. Basierend auf unserer Erfahrung, hat die High-Fidelity-Polymerase an sorgfältig ausgewählte und um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten getestet werden. Die einzige Begrenzung dieses Ansatzes kann in der Beobachtung, daß in den meisten Fällen etwa 30% der verarbeiteten Proben sind nicht ausnutzbar verbergen, entweder aufgrund der PCR oder Sequenzierungsschritten. Berücksichtigt man jedoch, daß die Isolierung neuer Coxiella Transposon-Mutanten keine geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist, bedeutet dies nicht REPREschickte ein wichtiges Thema. In ähnlicher Weise die Entwicklung eines zuverlässigen Test zur Bestimmung des Bakterienkonzentration von mutierten Bestände quantifizieren war der Schlüssel für diesen Ansatz. Aufgrund der Tendenz von Coxiella zu aggregieren, wenn sie in Suspension, ist die Verwendung von Ablesungen der optischen Dichte nicht anwendbar, um die Konzentration von Coxiella Kulturen und der einzigen Alternative war quantitative PCR (qPCR) zu berechnen. Hierbei ist die Verwendung einer fluoreszenzmarkierten DNA interkalierende Mittel signifikant Bakterioplankton Quantifizierung beschleunigt. Dieser Ansatz kann auch die Vorteile der Verwendung von stabilen Zelllinien, die Fluoreszenzmarker für mehrere intrazelluläre Kompartimente in Abhängigkeit von dem Erreger eingesetzt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Verwendung von Zellkulturmedien frei von Phenolrot. Wir beobachteten, dass dieser pH-Indikator hat eine natürliche Fluoreszenz überspannt den roten und grünen Spektrum, das die auf der automatisierten Fluoreszenzreader aufgezeichnete Signal sättigt. Ter hier vorgestellte Strategie beruht auf Zufalls Transposon-Mutagenese. Bei den Mutanten von Interesse, empfehlen wir die Validierung einzigartigen Trans (und Klonalität) mit Southern-Blot und PCR-Amplifikationen der Transposoninsertion Website. Neben der im Protokoll beschrieben Ausrüstung, Teams Interesse an der Nutzung der Screening-Ansatz hier präsentiert wird, werden große Vorteil in der Aufbau einer relationalen Datenbank für die Datensammlung, einem Server für die Datenspeicherung und einer Arbeitsstation für die schnelle Bildanalyse zu nehmen. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Methode ist für die Untersuchung von anderen intrazellulären bakteriellen Pathogenen geeignet vorgesehen eine zufällige Mutagenese-Verfahren für den Erreger vorhanden ist, können Zelllinien durch das Pathogen infiziert sein und diese zeigt einen spezifischen Phänotyp während der Infektion.

Die Schwellen, endemische Bakterium Coxiella burnetii ist für große Ausbrüche von Q-Fieber, eine schwächende Grippe-ähnliche Zoonose mit schweren gesundheitlichen und wirtschaftlichen Auswirkungen 1 verantwortlich. Die wichtigsten Lagerstätten von Coxiella sind Haus- und Nutztieren, und es wird geschätzt, dass mehr als 90% der Milchviehhaltung in den USA durchzuführen C. burnetii 2. Der Mensch ist ein versehentliches Hosts, die durch Inhalation kontaminierter Aerosole infiziert sind. Menschen Q-Fieber manifestiert entweder als akute oder chronische Krankheit, die tödlichen Komplikationen mit einer Mortalitätsrate erreichte 65% 1,3 haben. Mit einer infektiösen Dosis von 1 - 10 Organismen ist Coxiella das infektiöse Pathogen bekannt und es hat sich als potentielle biologische Waffe 4 untersucht worden. Die jüngste explosive Ausbruch von Q-Fieber in den Niederlanden (2007 - 2010), mit Fällen Eskalation von 182 auf mehr als 2.000 pro Jahr, steht als Beispiel für die schwere Virulenz des Erregers5. Die bemerkenswerte Effizienz Coxiella Infektionen wird wahrscheinlich mit seiner Resistenz gegen Umweltstress, kombiniert mit seiner einzigartigen Anpassung an Wirtszellen verbunden. Tatsächlich ist Coxiella in der Umgebung, in der Form von metabolisch inaktiven kleinzelligem Varianten (SCV), das bemerkenswert beständig gegenüber mehreren harten Bedingungen (Austrocknung, Temperatur, etc.) vorhanden sind. SCVs werden von Fresszellen via α V β 3 Integrin 6 genommen, während Invasion nicht-Fresszellen wird durch die Coxiella Adhäsion / Invasion OmpA 7 und einer noch nicht identifizierten Rezeptor vermittelt. Im Anschluss an die Aufnahme, wohnt Coxiella in eng anliegenden Vakuolen, positiv für den frühen endosomalen Marker Rab5 und EEA1 8. Bakterien reagieren auf endosomalen Ansäuerung durch die Umstellung auf metabolisch aktiven großen Zellvarianten (leichte Nutzfahrzeuge) und Aktivieren eines Dot / Icm Sekretionssystem vom Typ 4 (T4SS) 9, Hoch homolog zu der Legionella pneumophila 10. Die Sekretion von Dot / Icm Effektoren ermöglichen Coxiella, um eine große, LAMP1-positive sauren Raum mit aktiven lysosomalen Enzymen in denen sich Bakterien gedeihen können und aktiv infizierte Zellen vor Apoptose 11 zu erzeugen. Daher wird die intrazelluläre Zyklus Coxiella vom Dot / Icm vermittelte bakterielle Translokation Effektoren 12 gesteuert werden jedoch die mikrobielle Faktoren in Wirtszellinvasion, bakterielle Replikation und Verbreitung der Infektion beteiligt sind heute noch weitgehend unbekannt. Kombinieren Transposon-Mutagenese und Fluoreszenz-basierte Assays, entwickeln wir unvoreingenommene Ansätze zur gleichzeitigen Identifizierung von bakteriellen Faktoren in den Hauptschritten des Coxiella Infektionen beteiligt: ​​1) Internalisierung in Wirtszellen, 2) die intrazelluläre Replikation, 3) Zelle-zu-Zell-Ausbreitung und 4) Ausdauer. Bis heute haben wir mehr als 1.000 m geschirmtutations in 500 Coxiella kodierenden Sequenzen, die uns mit noch nie da gewesenen Einblick in die Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Coxiella Pathogenese 7 zu regulieren. Zu beachten ist, kann dieser Ansatz auf die Untersuchung von anderen intrazellulären Krankheitserreger, die Zellbiologie Funktionen mit Coxiella gemeinsam angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion und Kolonisierung von Wirtszellen, die durch bakterielle Pathogene, hängt von der Aktivität einer Vielzahl von prokaryotischen Proteinen, definiert als Virulenzfaktoren, die unterwandern und zu manipulieren Schlüsselaufnahmefunktionen. Die Studie von Wirt / Pathogen-Interaktionen ist daher äußerst wichtig, um bakterielle Infektionen zu verstehen und zu entwickeln alternative Strategien zur Infektionskrankheiten entgegenzuwirken. Dieser Ansatz erfordert jedoch die Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Assays für die unvoreingenommene, automatisierte Identifizierung und Charakterisierung von bakteriellen Virulenzfaktoren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung eines GFP-markierten Mutantenbibliothek durch Transposon-Mutagenese und der Entwicklung von High-Content-Screening-Ansätze für die gleichzeitige Identifizierung mehrerer Transposon-assoziierten Phänotypen. Unser Arbeitsmodell ist die intrazellulären bakteriellen Erreger Coxiella burnetii, der Erreger des Q-Fiebers Zoonose, die mit se verbunden istvere Ausbrüche mit einer daraus resultierenden gesundheitlichen und wirtschaftlichen Belastung. Die obligat intrazelluläre Natur des Erregers hat bis vor kurzem stark behindert die Identifizierung von bakteriellen Faktoren in Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen beteiligt, so dass von Coxiella das ideale Modell für die Umsetzung von Hochdurchsatz / High-Content-Ansätze.

Nach Isolierung der Transposon-Mutanten, ist Einzelprimer-Kolonie-PCR eine robuste, Hochdurchsatzverfahren, um die Website von Transposoninsertion für jede Mutante zu identifizieren. Dieser Ansatz beruht auf einem typischen nested PCR-Protokoll aber hier ein einzelner Primer hybridisiert spezifisch und / oder unspezifisch an der Matrizen-DNA in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur (1A). Die typischen PCR-Produkte bestehen aus mehreren DNA-Fragmenten, von denen die meisten spezifisch sind (1B). Die Verwendung eines unterschiedlichen Sequenzierungsprimer, die direkt stromaufwärts des Transposons ITR, und stromabwärts des durch den Amplifikationsprimer erkannte Sequenz annealt bietet Spezifität für die Sequenzierungsschritt (Figur 1C). Automatisierte Software für die Sequenzanalyse richtet die erhaltenen Sequenzen an die Coxiella Genom Bereitstellung der genaue Ort der Transposoninsertionen (Abbildung 1c). Alle Transposoninsertionen kann dann annauf der Coxiella Genom (1D) otated. Jedes Coxiella Mutante isoliert und axenisch in ACCM-2-Medium entweder vor der Lagerung oder Screening amplifiziert. 2 zeigt ein Beispiel eines 38-Transposon-Mutanten in 16 Punkten / ICM Coxiella Gene (2A). Um die Lebensfähigkeit von Coxiella Mutanten zu beurteilen, werden axenischen Wachstumskurven durch Abtasten Bakterienkulturen für 7 Tage nach der Inokulation und Anwenden des in 1.5 (Figurie 2B) beschriebenen Bakterienkonzentration Assay erhalten. Amplifizierten Mutanten werden dann mit Epithelzellen für 7 Tage inkubiert, in dreifacher Platten mit 96 Vertiefungen. Alle Coxiella Mutanten erzeugt, die GFP-markierten, intrazellulären Wachstumskurven werden durch Messung der Fluoreszenzintensität der GFP jeden gut, alle 24 Stunden, und Aufzeichnen der Messwerte als Funktion der Zeit (2C) erhalten. Intrazellulären Wachstumskurven stellen die quantitative Analyse der Phänotypen mit jedem Transposoninsertion im Coxiella Genom assoziiert. Um qualitative Informationen zu den gleichen Transposonmutanten hinzuzufügen, haben wir uns für die automatisierte Bildaufnahme und Analyse. Sieben Tage nach der Infektion, Platten befestigt sind, verarbeitet für Immunfluoreszenz, wie in 4 beschrieben und mit Hilfe eines automatisierten, Epifluoreszenzmikroskop wie in 5. Automatisierte Bildanalyse-Software beschrieben, wie CellProfiler (Broad Institute, analysiert <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) verarbeitet die erfassten Kanäle unabhängig und Segmente Objekten für eine vergleichende Analyse (Figur 3) identifiziert. Dies ermöglicht die Identifikation und morphologische Charakterisierung von Wirtszellkerne, Zellen Konturen, Lysosomen und Coxiella Kolonien (Abbildung 3 oberen Felder). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellen und ermöglicht die Lysosomen Bestandtauf und spezifische morphologische Analyse von Coxiella enthaltenden Vakuolen (die LAMP1 positive, 3 unteren linken Bereich sind). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Wirtszelle Konturen ermöglicht die Identifizierung und spezifische morphologische Analyse von infizierten Zellen (Abbildung 3 unten Mitte). Schließlich werden die 4 Kanäle zur Veranschaulichung und Qualitätskontrolle (Abbildung 3 unten rechts) zusammengeführt. Von der automatisierten Bildanalyse erhaltenen Daten können gegeneinander aufgetragen werden, um &quot;Mehr phänotypische Streudiagramme&quot; zu erhalten. Als ein Beispiel in Figur 4A die mittlere Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Kolonien pro Zelle (4A) aufgetragen wird, um Veränderungen, die die intrazelluläre Replikation des Coxiella (Replikationsphenotyp) und / oder beeinflussen zu identifizieren die Fähigkeit von Bakterien an Wirtszellen eindringen (internasierung Phänotyp). Die statistische Analyse wurde verwendet, um Regionen in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 &lt;Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Mutanten wurden in 3 Hauptcluster beobachtet: Mutationen, die zu einer fehlerhaften intrazelluläre Wachstum von Coxiella Folge wurden in der äußersten linken Teil der Handlung (4A, rosa und rote Punkte) gruppiert sind; Mutationen, die Coxiella Internalisierung in Zellen betroffen waren im unteren Teil des Grundstücks gruppiert (4A, helle und dunkle blaue Punkte) und schließlich grünen Punkten in der äußersten rechten Bereich des Grundstücks entsprechen Mutationen in nicht-signifikanten Phänotypen ( Z-Score&gt; -2). Wichtig ist, dass Mutanten, die zur Replikation ausfallen, aber noch in der Lage, um Wirtszellen eindringen, werden nach 7 Tagen der Infektion als einzelne Bakterien oder kleinen Kolonien, angrenzend an Zellkernen (4C, zweite Grafik) Wirt erkannt. Daher ist die Größe der Coxiella &quot;Colomen &quot;wird erheblich beeinflusst werden, aber die Anzahl der infizierten Zellen werden nicht im Vergleich zu WT Coxiella infizierten Zellen variieren. Im Gegenteil, Mutationen, die die Fähigkeit von Coxiella, Wirtszellen eindringen beeinflussen zu einer Abnahme in der Anzahl von Kolonien / Zelle. Wenn diese Zahl deutlich unterhalb von 1 ist, zeigt dies, dass, im Durchschnitt, gibt es eine Abnahme in der Gesamtzahl der infizierten Zellen. Alternativ kann die Durchschnittsfläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Wirtszellen, die die Infektion (4B), aufgetragen werden, um Mutationen, die Zytotoxizität Coxiella (zytotoxische Phänotyp) verleihen identifizieren. Wie oben wurde die statistische Analyse verwendet, um Bereiche in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 &lt;Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Die meisten Mutationen gescreent nicht signifikant auf das Überleben der Zelle, unabhängig von bakteriellen Replikations im WirtsZellen (3B grüne Punkte). 37 Mutationen leicht betroffen Wirtszelle Überleben (3B, leicht rote Punkte) und 7 Mutationen waren besonders schädlich für das Überleben der Zellen (3B, dunkle rote Punkte) hosten. Bitte beachten Sie, dass durch die automatisierte Bildanalyseverfahren erhalten zusätzliche Parameter können verwendet werden, um den übrigen Diagrammen abgeleitet werden, je nach experimentellen Anforderungen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Abb. 1: Die Sequenzierung und Annotation von Coxiella Transposon-Mutanten (A) Einzelprimer Kolonie-PCR wird verwendet, um DNA-Fragmente, die die Stelle der Transposon-Insertion zu verstärken. Amplifikationsprimer (Amp) sowohl als spezifische und unspezifische Primer in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur verwendet. (B) Typische Ergebnis der Einzelprimer-Kolonie-PCR. Jede Reactiauf produziert eine Anzahl von Fragmenten unterschiedlicher Größe, von denen einige das Transposon Insertionsstelle enthält; einige andere zufällig als Nebenprodukte der PCR-Zyklus niedriger Stringenz amplifiziert. (C) Die Verwendung eines Sequenzierungsprimer (Seq), der auf einem Transposon-Sequenz hybridisiert, kann die Sequenzierung der Fragmente von Interesse. (D) Die Sequenzanalyse-Software ermöglicht die automatische Annotation von Transposoninsertionen auf das bakterielle Genom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Abb. 2: Axenic und intrazelluläre Wachstum von Coxiella Transposon-Mutanten (A) In der Pilotschirm haben wir in 16 Kern g isoliert, sequenziert und abgeschirmt 38 Transposon-Mutantenenen der Coxiella dot / icm-Sekretionssystem (rot gekennzeichnet). (B) Um die Rentabilität der einzelnen Transposon-Mutante zu bewerten, das Wachstum je Isolat in axenischen Kulturmedium wird über 8 Tage mit einem fluoreszenzmarkierten DNA-Interkalationsmittel überwacht. (C) jede Mutante wird dann verwendet, um Epithelzellen zu infizieren. Wie das Transposon besitzt eine GFP Kassette wird intrazellulären Bakterienwachstum mehr als 7 Tage nach der Infektion, indem Sie die Variationen der GFP-Fluoreszenz mit Coxiella Replikation verbunden ist, unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader überwacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3: Automatisierte Bildanalyse von Coxiella Infektionen Ein Auto.Zusammengesetzte Epifluoreszenzmikroskop wird zur Abbildung 21 Positionen pro Loch von dreifachen 96-Well-Platten. Die Bildanalyse-Software Segmente Objekten in jeder erworbenen Kanäle für die Quantifizierung und Analyse. In allen Fällen werden die Gegenstände berühren den Rand der Bilder ausgeschlossen. (A) Die Hoechst-Kanal wird verwendet, um Wirtszellkerne zu identifizieren (in grün markiert). (B) Diese werden als Keime verwendet werden, um Wirtszellkonturen im Cy3-Kanal zu identifizieren (die Position der Kerne blau eingekreist sind Zellkonturen in grün). (C) Das Cy5-Kanal wird verwendet, um LAMP1-positive Fächer zu identifizieren (in grün eingekreist); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen (in rot) enthalten Objekte für die Bildanalyse erhalten. (D) Die GFP-Kanal wird verwendet, um Coxiella Kolonien zu identifizieren (in grün markiert). (E) Korrelieren Coxiella Kolonien mit LAMP1 positive Abteilen ermöglicht die Identifizierung von Coxiella </em&gt; Enthaltenden Vakuolen (CCV); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen enthalten Objekte (in grün) für die Bildanalyse erhalten. (F) Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellkonturen ermöglicht die Identifizierung von infizierten Zellen (pseudocolored). (G) in den 4 Fluoreszenzkanälen erworbene Bilder (entsprechend Coxiella Kolonien (grün), Wirtszellkerne (blau), Wirtszellplasmamembran (grau), LAMP1-positive Fächer (rot)) werden zusammengeführt und für die Darstellung und Qualität verwendet Kontrolle. Maßstabsbalken 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Abbildung 4: Groß Identifizierung von Coxiella Faktoren in Wirts Mitmachen / Pathogen interagierenIonen. (A) Die durchschnittliche Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die relative Anzahl der Kolonien pro Zelle aufgetragen ist, um die Replikation und Internalisierung Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score&gt; -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa und Hellblau Punkte stehen für die Replikation und Internalisierung Phänotypen jeweils mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rot und dunkelblau Punkte stellen Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). (B) Die mittlere Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien wurde an der Gesamtzahl von Zellen (infiziert und nicht infiziert), dass 7 Tage nach der Infektion auf die zytotoxische Wirkung von Transposoninsertionen resultierende Schätzung lebten aufgetragen. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score&gt; -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa Punkte stellen zytotoxische phenotypes mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rote Punkte stehen für zytotoxische Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). Die Pfeile zeigen die Mutanten durch den entsprechenden Kleinbuchstaben in C (C) veranschaulicht repräsentative Bilder der Replikation, Internalisierung und zytotoxische Phänotypen. In allen Fällen sind Wirtszellkerne in rot, sind Coxiella Kolonien in grün. Maßstabsbalken 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

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