Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
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This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. 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S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

मेजबान / रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के जीवाणु संक्रमण को समझते हैं और संक्रामक रोगों का मुकाबला करने के लिए वैकल्पिक रणनीति विकसित करने के लिए एक उल्लेखनीय विधि साबित हो गया है। हालांकि, अलग बैक्टीरियल रोगज़नक़ों द्वारा सविस्तार रणनीतियों की विविधता के लिए, बैक्टीरियल विषैलापन कारकों की और संक्रमण के दौरान लक्षित कर रहे हैं कि रास्ते संकेतन मेजबान की पहचान और लक्षण वर्णन एक असली चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह कुंजी मेजबान / रोगज़नक़ बातचीत केन्द्रों में बड़े पैमाने पर पहचान के लिए नए तरीकों के विकास के लिए कहता है। अभिनव, उच्च throughput और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक का हाल ही में विकास इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल रोगज़नक़ों 15 का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि एक अमूल्य संसाधन का प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ, हम transposon उत्परिवर्तजनन और प्रतिदीप्ति आधारित assays कि गठबंधन स्क्रीनिंग दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक मॉडल के रूप में जूनोटिक बैक्टीरियल रोगज़नक़ Coxiella burnetii का इस्तेमाल किया है। Importantly, इस स्क्रीनिंग विधि, आक्रमण दोहराने के लिए और संक्रमित कोशिकाओं के भीतर जारी रहती है इस जीवाणु द्वारा विकसित की रणनीतियों में से एक वैश्विक सिंहावलोकन प्रदान करने, Coxiella इंट्रासेल्युलर चक्र के कई चरणों के एक साथ निगरानी की अनुमति देता है। यहाँ वर्णित दृष्टिकोण सफलतापूर्वक बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के अध्ययन के लिए लागू किया गया है जो दो अच्छी तरह से स्थापित तकनीक, transposon उत्परिवर्तजनन और प्रतिदीप्ति आधारित assays, पर आधारित है। उच्च throughput / उच्च सामग्री स्क्रीन के संदर्भ में इन तकनीकों का मेल हमें घटनाओं की एक बहुत ही उच्च संख्या (बैक्टीरिया म्यूटेशन प्रति आम तौर पर 15,000 संक्रमित कोशिकाओं imaged और विश्लेषण कर रहे हैं) का विश्लेषण करके बैक्टीरियल म्यूटेशन के एक उच्च संख्या के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है। इस तरह, स्वभाव से, उच्च परिवर्तनशीलता के अधीन हैं, जो मेजबान कोशिकाओं और intracellular प्रतिकृति, के जीवाणु आक्रमण के रूप में की घटनाओं का एक महत्वपूर्ण सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदान करता है। यह ईपी के अलावा अन्य है कि सेल लाइनों नोट करना महत्वपूर्ण हैithelial स्क्रीनिंग के इस प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मेजबान सेल organelles पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि फ्लैट और बड़े उपकला कोशिकाओं छवि विश्लेषण के लिए इष्टतम है। स्वचालित माइक्रोस्कोप के बहुमत स्वचालित रूप से प्लेटों की एक बड़ी संख्या को संभाल कर सकते हैं, साथ ही साथ जांच की जा सकती है कि म्यूटेंट की संख्या के लिए वास्तव में कोई सीमा नहीं है। रोगज़नक़ पर निर्भर करता है, कर सकते हैं उपयोगकर्ता विशेषाधिकार एक epifluorescence या एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करें। छवि अधिग्रहण के समय ज्यादातर प्रति अच्छी तरह से और देखने के क्षेत्र में प्रति हासिल कर ली चैनलों की संख्या पर अधिग्रहीत क्षेत्रों की संख्या पर, माइक्रोस्कोप कैमरे की संवेदनशीलता पर निर्भर करेगा। उपयोगकर्ता स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए इन कारकों को समायोजित करने के लिए कैसे तय कर सकते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम बिंदु 5.1 में संकेत दिया शर्तों का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली / घंटा imaged। छवि विश्लेषण काफी हद तक इस्तेमाल किया मशीन (या मशीनों के क्लस्टर) पर निर्भर करता है। हम एक 12-कोर (2 एक्स 3.06 गीगा 6-कोर), 48 जीबी रैम कार्य केंद्र का उपयोग करें। इस मशीन का अनुमानित आवश्यकता हैmately 40 मिनट से एक थाली से प्राप्त कर लिया छवियों का विश्लेषण करने के लिए। इन assays के विकास के नए सेट अप (या मौजूदा का अनुकूलन) के नमूनों की एक बड़ी संख्या में हेरफेर और प्रसंस्करण की अनुमति देने का प्रोटोकॉल है जब एक महत्वपूर्ण पहलू को ध्यान में रखा जाना है। एक विशिष्ट उदाहरण हमें तेजी से बढ़ाना और करने के लिए अनुमति दी है जो एक प्राइमर कॉलोनी पीसीआर दृष्टिकोण का विकास है, बहुत छोटे नमूनों से, प्रत्येक transposon की प्रविष्टि की साइट युक्त अनुक्रम Coxiella डीएनए टुकड़े। हमारे अनुभव के आधार पर, उच्च निष्ठा पोलीमर्स ध्यान से चयनित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के क्रम में परीक्षण किया जाना है। इस दृष्टिकोण का ही सीमा, मामलों के बहुमत में, संसाधित नमूनों के बारे में 30% से दोहन नहीं कर रहे हैं, अवलोकन में पीसीआर या अनुक्रमण चरणों की वजह से या तो छिपा सकते हैं। बहरहाल, नए Coxiella transposon म्यूटेंट के अलगाव के एक दर सीमित कदम नहीं है, विचार है कि इस प्रतिनिधि नहीं करताएक प्रमुख मुद्दा भेजा है। इसी तरह, उत्परिवर्ती शेयरों के जीवाणु एकाग्रता यों के लिए एक विश्वसनीय परख के विकास के इस दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण हो गया है। जब निलंबन में कुल करने के लिए Coxiella की प्रवृत्ति के कारण, ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग का उपयोग किया गया Coxiella संस्कृतियों और केवल मौजूदा विकल्प की एकाग्रता मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) की गणना करने के लिए लागू नहीं है। इधर, एक fluorescently में चिह्नित डीएनए intercalating एजेंट का उपयोग काफी बैक्टीरिया quantitation के तेजी। यह दृष्टिकोण भी इस्तेमाल किया रोगज़नक़ के आधार पर कई intracellular डिब्बों के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त स्थिर सेल लाइनों के उपयोग का लाभ ले सकते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू फिनोल लाल से रहित सेल संस्कृति मीडिया का इस्तेमाल होता है। हम इस पीएच सूचक स्वचालित प्रतिदीप्ति पाठक पर दर्ज संकेत संतृप्त है कि लाल और हरे रंग स्पेक्ट्रम फैले प्राकृतिक प्रतिदीप्ति है कि मनाया। टीवह यहाँ प्रस्तुत रणनीति यादृच्छिक transposon उत्परिवर्तजनन पर निर्भर करता है। ब्याज की म्यूटेंट के लिए, हम दक्षिणी धब्बा और transposon प्रविष्टि साइट की पीसीआर amplifications का उपयोग कर अद्वितीय प्रतिस्थापन मान्य कर (और क्लोनालिटी) की सलाह देते हैं। प्रोटोकॉल खंड में वर्णित उपकरणों के अलावा, यहाँ प्रस्तुत स्क्रीनिंग दृष्टिकोण उपयोग करने में रुचि टीमों, डेटा संग्रह, डेटा भंडारण के लिए एक सर्वर और तेजी से छवि विश्लेषण के लिए एक कार्य केंद्र के लिए एक संबंधपरक डेटाबेस का सेट अप करने में बहुत लाभ ले जाएगा। महत्वपूर्ण बात है, यहाँ अन्य इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के अध्ययन के लिए अनुकूल है वर्णित विधि एक यादृच्छिक उत्परिवर्तजनन विधि रोगज़नक़ के लिए मौजूद है, बशर्ते सेल लाइनों रोगज़नक़ से संक्रमित हो सकता है और यह एक संक्रमण के दौरान एक विशिष्ट फेनोटाइप प्रदर्शित करता है।

इमर्जिंग, स्थानिक जीवाणु Coxiella burnetii क्यू बुखार, गंभीर स्वास्थ्य और आर्थिक प्रभाव 1 के साथ एक दुर्बल फ्लू जैसे पशुजन्य रोग की बड़ी फैलने के लिए जिम्मेदार है। Coxiella के मुख्य जलाशयों घरेलू और खेत जानवरों रहे हैं, और यह अमेरिका में डेयरी पशु के 90% से अधिक सी है कि ले जाने का अनुमान है 2 burnetii। मनुष्य दूषित एरोसोल की साँस लेना द्वारा संक्रमित हैं कि आकस्मिक मेजबान हैं। मानव क्यू बुखार से प्रकट होता है, या तो 65% 1,3 तक पहुँचने मृत्यु दर के साथ घातक जटिलताएं हो सकती है जो एक तीव्र या पुरानी बीमारी, के रूप में। 1 के एक संक्रामक खुराक के साथ - 10 जीवों, Coxiella जाना जाता है सबसे अधिक संक्रामक रोगजनक है और यह एक संभावित जैव हथियार के रूप में 4 जांच की गई है। नीदरलैंड (2007 - 2010) में क्यू बुखार की हाल ही में विस्फोटक प्रकोप मामलों में प्रति वर्ष 2,000 से अधिक करने के लिए 182 से बढ़ते के साथ, इस रोगज़नक़ के गंभीर डाह का एक उदाहरण के रूप में खड़ा है5। Coxiella संक्रमण की उल्लेखनीय दक्षता संभावना कोशिकाओं की मेजबानी के लिए अपनी अनूठी अनुकूलन के साथ संयुक्त पर्यावरण के तनाव के लिए अपने प्रतिरोध के साथ जुड़ा हुआ है। दरअसल, Coxiella कई कठोर परिस्थितियों (सुखाना, तापमान, आदि) के लिए उल्लेखनीय प्रतिरोधी रहे हैं, जो पाचन निष्क्रिय छोटे सेल वेरिएंट (SCV), के रूप में वातावरण में मौजूद है। गैर phagocytic कोशिकाओं के आक्रमण Coxiella आसंजन / आक्रमण OMPA 7 और एक अभी तक अज्ञात रिसेप्टर द्वारा मध्यस्थता है, जबकि SCVs ऊपर से 3 integrins 6 β α वी के माध्यम से phagocytic कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है। तेज के बाद, Coxiella Rab5 और EEA1 8 जल्दी endosomal मार्करों के लिए सकारात्मक चुस्त रिक्तिकाएं, में रहता है। जीवाणु एक डॉट / आईसीएम प्रकार 4 स्राव सिस्टम (T4SS) 9 पाचन सक्रिय बड़े सेल वेरिएंट (एलसीवी) को परिवर्तित करने और सक्रिय द्वारा endosomal अम्लीकरण का जवाब, लीजोनेला pneumophila 10 की है कि अत्यधिक मुताबिक़। डॉट / आईसीएम प्रभावोत्पादक का स्राव Coxiella बैक्टीरिया पनपे और सक्रिय रूप से एपोप्टोसिस 11 से संक्रमित कोशिकाओं की रक्षा कर सकते हैं जहां सक्रिय लाइसोसोमल एंजाइमों युक्त एक बड़े, LAMP1 पॉजिटिव अम्लीय डिब्बे उत्पन्न करने के लिए अनुमति देते हैं। इसलिए, Coxiella के intracellular चक्र बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक 12 के डॉट / आईसीएम की मध्यस्थता स्थानान्तरण द्वारा नियंत्रित किया जाता है, हालांकि, मेजबान सेल आक्रमण, बैक्टीरियल प्रतिकृति है और संक्रमण के प्रसार में शामिल माइक्रोबियल कारकों काफी हद तक अनजान रहते हैं। मेजबान कोशिकाओं के भीतर 1) internalization, 2) इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति, 3) सेल के लिए सेल प्रसार: transposon उत्परिवर्तजनन और प्रतिदीप्ति आधारित assays के संयोजन, हम Coxiella संक्रमण के मुख्य चरण में शामिल बैक्टीरियल कारकों का एक साथ पहचान के लिए निष्पक्ष दृष्टिकोण विकसित कर रहे हैं , और 4) हठ। तिथि करने के लिए, हम 1,000 मीटर से अधिक जांच की हैCoxiella रोगजनन 7 को नियंत्रित करने वाले मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान की है जो 500 Coxiella कोडिंग दृश्यों में utations। ध्यान से, इस दृष्टिकोण Coxiella साथ कोशिका जीव विज्ञान सुविधाओं का हिस्सा है कि अन्य इंट्रासेल्युलर रोगजनकों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

आक्रमण और बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के मेजबान कोशिकाओं के उपनिवेशन नाश और चाबी मेजबान कार्यों में हेरफेर कर सकते हैं जो विषैलापन कारकों के रूप में परिभाषित प्रोकार्योटिक प्रोटीन की एक बड़ी संख्या है, की गतिविधि पर निर्भर करते हैं। मेजबान / रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के जीवाणु संक्रमण को समझते हैं और संक्रामक रोगों का मुकाबला करने के लिए वैकल्पिक रणनीति विकसित करने के लिए इसलिए बेहद जरूरी है। यह दृष्टिकोण हालांकि, बैक्टीरियल विषैलापन निर्धारकों की निष्पक्ष, स्वचालित पहचान और लक्षण वर्णन के लिए नए उच्च throughput assays के विकास की आवश्यकता है। यहाँ, हम transposon उत्परिवर्तजनन द्वारा एक GFP टैग उत्परिवर्ती पुस्तकालय की पीढ़ी के लिए एक विधि का वर्णन है और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के विकास के कई transposon जुड़े phenotypes की एक साथ पहचान के लिए दृष्टिकोण। हमारा काम मॉडल एसई के साथ जुड़ा हुआ है जो इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल रोगज़नक़ Coxiella burnetii, पशुजन्य रोग क्यू बुखार की etiological एजेंट है,वेरे एक फलस्वरूप स्वास्थ्य और आर्थिक बोझ के साथ प्रकोप। इस रोगज़नक़ के लाचार इंट्रासेल्युलर प्रकृति, हाल ही में जब तक, गंभीर रूप से Coxiella के उच्च throughput / उच्च सामग्री दृष्टिकोणों के कार्यान्वयन के लिए आदर्श मॉडल है, जिससे मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में शामिल बैक्टीरियल कारकों की पहचान बाधा उत्पन्न की है।

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii जूनोटिक बीमारी क्यू बुखार के लिए जिम्मेदार एक लाचार इंट्रासेल्युलर ग्राम नकारात्मक जीवाणु है। यहाँ हम Coxiella फ्लोरोसेंट transposon म्यूटेंट की पीढ़ी के रूप में अच्छी तरह से स्वचालित पहचान और जिसके परिणामस्वरूप internalization, प्रतिकृति और साइटोटोक्सिक phenotypes के विश्लेषण के लिए विधियों का वर्णन।

जनरेशन और मल्टी-प्ररूपी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon म्यूटेंट

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

एक जेनेटिक पृथक करने के लिए स्क्रीन Toxoplasma gondii मेजबान सेल निकास म्यूटेंट

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

एक स्वचालित उच्च सामग्री zebrafish में सूजन परख को सुगम ड्रग डिस्कवरी

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं की piggyBac Transposon सिस्टम संशोधन

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

उच्च थ्रूपुट/उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरिया के क्वांटिफिकेशन के लिए एक सूक्ष्म फेनोटाइपिक परख

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

में Alginate उत्पादन से जुड़े उपन्यास जीन की पहचान<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; का प्रयोग मिनी<em&gt; Himar1</em&gt; मेरिनर transposon की मध्यस्थता Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

की जांच के लिए Lyophilized लूप की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन अभिकर्मकों का विकास<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

लागू करने प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) द्वारा प्रेरक translocation क्षमता की जांच करने के लिए<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA मुंह बंद के दौरान

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

गोल्डन सीरियाई हंसटर संक्रमण के दौरान Leptospira interrogans Transposon प्रविष्टि म्यूटेंट की फिटनेस को मापने के लिए उच्च प्रवाह समानांतर अनुक्रमण

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

आदेशित, अनावश्यक लायब्रेरी की प्रतिकृति Pseudomonas aeruginosa तनाव PA14 Transposon लन म्यूटेंट

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces विकासात्मक म्यूटेंट का दृश्य एवं सूक्ष्म मूल्यांकन

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...