Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Lo studio delle interazioni ospite / patogeno ha dimostrato di essere un metodo notevole per capire infezioni batteriche e sviluppare strategie alternative per contrastare malattie infettive. Tuttavia, a causa della diversità delle strategie elaborate da diversi batteri patogeni, l&#39;identificazione e la caratterizzazione di fattori di virulenza batterici e dell&#39;ospite vie di segnalazione che sono indirizzate durante le infezioni rappresentano una vera e propria sfida. Ciò richiede lo sviluppo di nuovi approcci per l&#39;identificazione su larga scala dei nodi principali di interazione ospite / patogeno. Il recente sviluppo di prodotti innovativi, ad alto throughput e tecniche di screening ad alto contenuto rappresenta una preziosa risorsa che può essere adattato allo studio di batteri patogeni intracellulari 15. Qui, abbiamo usato il zoonotici batterica patogeno coxiella burnetii come modello per sviluppare approcci di screening che combinano transposon mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza. Importantemente, questo metodo di screening consente il monitoraggio simultaneo di molteplici fasi del ciclo intracellulare Coxiella, fornendo una panoramica globale delle strategie sviluppate da questo batterio di invadere, replicare e persistono all&#39;interno delle cellule infette. L&#39;approccio qui descritto si basa su due tecniche ben consolidate, trasposone mutagenesi e saggi basati sulla fluorescenza, che sono state applicate con successo allo studio di batteri patogeni. Combinando queste tecniche nel contesto di schermi ad alta produttività / elevato contenuto permette di valutare gli effetti di un elevato numero di mutazioni batteriche analizzando un numero molto elevato di eventi (tipicamente 15.000 cellule infettate per mutazioni batteriche vengono esposte e analizzati). Ciò fornisce un importante analisi statistica di eventi come invasione batterica delle cellule ospiti e la replica intracellulare, che sono, per natura, ad una elevata variabilità. È importante notare che le linee cellulari diverse epithelial può essere utilizzato per questo tipo di screening. Tuttavia, le cellule epiteliali piatte e grandi sono ottimali per l&#39;analisi delle immagini come organelli delle cellule ospiti sono più facili da individuare. Poiché la maggior parte dei microscopi automatici può gestire automaticamente un gran numero di piatti, non ci sono limiti al numero di mutanti che possono essere proiettati contemporaneamente. A seconda del patogeno, il privilegio utente può l&#39;uso di un epifluorescenza o un microscopio confocale. Il tempo di acquisizione dell&#39;immagine sarà principalmente dipende dalla sensibilità della telecamera microscopio, il numero di campi acquisiti per pozzetto e dal numero di canali acquisiti per campo di vista. L&#39;utente può decidere come regolare questi fattori per ottimizzare il protocollo di screening. A titolo di esempio, abbiamo ripreso una 96-pozzetti / h utilizzando le condizioni di cui al punto 5.1. L&#39;analisi delle immagini dipende in gran parte la macchina (o cluster di macchine) utilizzato. Usiamo un 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB di RAM workstation. La macchina richiede approxirca 40 minuti per analizzare le immagini acquisite da una piastra. Un aspetto importante da prendere in considerazione nella preparazione di queste analisi è la messa a punto di nuovi (o l&#39;ottimizzazione di protocolli esistenti) per consentire la manipolazione e il trattamento di un gran numero di campioni. Un esempio tipico è lo sviluppo della singola colonia di primer PCR approccio, che ha permesso di amplificare rapidamente e frammenti di sequenza di DNA contenenti Coxiella il sito di inserimento di ciascun trasposone, da campioni molto piccoli. Sulla base della nostra esperienza, la polimerasi ad alta fedeltà deve essere attentamente selezionati e testati per ottenere risultati riproducibili. L&#39;unica limitazione di questo approccio può nascondere nell&#39;osservazione che, nella maggior parte dei casi, circa il 30% dei campioni trattati non sono sfruttabili, sia a causa della PCR o la procedura di sequenziamento. Tuttavia, considerando che l&#39;isolamento di nuovi mutanti di trasposoni Coxiella non è un fattore limitante, questo non rappreinviato un grosso problema. Analogamente, lo sviluppo di un test affidabile per quantificare la concentrazione batterica delle scorte mutanti è stato fondamentale per questo approccio. A causa della tendenza ad aggregarsi Coxiella quando in sospensione, l&#39;uso di letture di densità ottica non è applicabile per calcolare la concentrazione di culture Coxiella e l&#39;unica alternativa esistente era PCR quantitativa (qPCR). Qui, l&#39;uso di un DNA agente intercalante fluorescente contrassegnati notevolmente accelerato batteri quantificazione. Questo approccio può anche sfruttare l&#39;uso di linee cellulari stabili esprimenti marcatori fluorescenti per diversi compartimenti intracellulari seconda patogeno utilizzato. Un altro aspetto importante è l&#39;uso di colture cellulari privo di rosso fenolo. Abbiamo osservato che questo indicatore pH ha una fluorescenza naturale attraversa spettro rosso e verde che satura il segnale registrato sul lettore di fluorescenza automatizzato. Tegli strategia qui presentata si basa su casuale mutagenesi trasposoni. Per i mutanti di interesse, si consiglia di convalidare trasposizioni unici (e clonalità) con Southern blot e PCR amplificazioni del sito di inserimento trasposoni. Oltre al materiale descritto nella sezione protocollo, squadre interessate a utilizzare l&#39;approccio di screening qui presentato, avranno grande vantaggio nel set up di un database relazionale per la raccolta dati, un server per la memorizzazione dei dati e di una stazione di lavoro per l&#39;analisi delle immagini rapida. È importante sottolineare che il metodo qui descritto è adatto per lo studio di altri patogeni batterici intracellulari fornito un metodo di mutagenesi casuale esiste per il patogeno, linee cellulari possono essere infettati dal patogeno e questo mostra un fenotipo specifico durante l&#39;infezione.

L&#39;emergente, batterio endemico Coxiella burnetii è responsabile di grandi epidemie di febbre Q, una debilitante zoonosi simil-influenzale con grave salute e l&#39;impatto economico 1. I principali serbatoi di Coxiella sono animali domestici e da fattoria, e si stima che oltre il 90% dei bovini da latte negli Stati Uniti portano C. burnetii 2. Gli esseri umani sono ospiti accidentali che vengono infettati da inalazione di aerosol contaminati. Febbre Q umana si manifesta sia come una malattia acuta o cronica, che può avere complicanze fatali, con un tasso di mortalità raggiunge il 65% 1,3. Con una dose infettiva di 1 - 10 organismi, Coxiella è il patogeno più infettiva noto ed è stato studiato come potenziale arma bio 4. La recente epidemia esplosiva di febbre Q nei Paesi Bassi (2007 - 2010), con casi crescente da 182 a più di 2.000 all&#39;anno, si pone come un esempio della grave virulenza di questo patogeno5. La notevole efficienza di infezioni Coxiella è probabilmente associata con la sua resistenza allo stress ambientale, in combinazione con il suo adattamento unico di ospitare le cellule. Infatti, Coxiella è presente nell&#39;ambiente sotto forma di varianti metabolicamente inattive a piccole cellule (SCV), che sono notevolmente resistenti alle diverse condizioni difficili (essiccamento, temperatura, etc.). Distributori sono up presa da fagociti via α V β 3 integrine 6 mentre l&#39;invasione delle cellule non fagocitiche è mediato dal Coxiella adesione / invasione OmpA 7 e un recettore non ancora identificato. Dopo l&#39;assorbimento, Coxiella risiede in vacuoli aderenti, positivi per i marcatori endosomali primi Rab5 e EEA1 8. I batteri rispondono a endosomiale acidificazione convertendo alle varianti a grandi cellule metabolicamente attive (LCV) e l&#39;attivazione di un sistema di secrezione di tipo 4 Dot / Icm (T4SS) 9, Altamente omologa a quella di Legionella pneumophila 10. La secrezione di effettori Dot / ICM consente coxiella di generare un grande vano acido LAMP1-positivo contenente enzimi lisosomiali attivi dove i batteri possono prosperare e attivamente proteggere le cellule infette da apoptosi 11. Pertanto, il ciclo di intracellulare Coxiella è controllata dalla traslocazione Dot / Icm-mediata di effettori batterici 12, tuttavia, i fattori microbici coinvolti nell&#39;invasione cellula ospite, replicazione batterica e la diffusione dell&#39;infezione sono generalmente poco noti. La combinazione di trasposoni mutagenesi e analisi basate sulla fluorescenza, stiamo sviluppando approcci imparziali per l&#39;identificazione simultanea di fattori batterici coinvolti nelle fasi principali di infezioni Coxiella: 1) internalizzazione all&#39;interno delle cellule ospiti, 2) la replica intracellulare, 3) spread cella-a-cella e 4) la persistenza. Fino ad oggi, abbiamo proiettato oltre 1.000 mutations in 500 sequenze Coxiella codificanti, che ci ha fornito intuizioni senza precedenti nelle interazioni ospite-patogeno che regolano Coxiella patogenesi 7. Da notare, questo approccio può essere applicato allo studio di altri patogeni intracellulari che condividono caratteristiche di biologia cellulare con Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasione e la colonizzazione delle cellule ospiti di batteri patogeni dipendono dall&#39;attività di un gran numero di proteine ​​procariotiche, definite come fattori di virulenza, che può sovvertire e manipolare funzioni host chiave. Lo studio delle interazioni ospite / patogeno è quindi estremamente importante per comprendere le infezioni batteriche e di sviluppare strategie alternative per combattere le malattie infettive. Questo approccio tuttavia, richiede lo sviluppo di nuovi saggi high throughput per la imparziale, l&#39;identificazione automatica e la caratterizzazione dei determinanti di virulenza batterica. Qui, si descrive un metodo per la generazione di una libreria mutante GFP-tagged by trasposone mutagenesi e lo sviluppo di screening ad alto contenuto di approcci per l&#39;identificazione simultanea di più fenotipi trasposoni-associata. Il nostro modello di lavoro è intracellulare batterica burnetii patogeno Coxiella, l&#39;agente eziologico della febbre zoonosi Q, che è associato con sévere epidemie con un conseguente onere sanitario e economico. La natura obbligato intracellulare di questo patogeno è, fino a poco tempo, gravemente ostacolato l&#39;identificazione dei fattori batterici coinvolti nella patogeno ospite, rendendo di Coxiella il modello ideale per l&#39;attuazione di approcci high-throughput / alto contenuto.

Dopo l&#39;isolamento di mutanti di trasposoni, singola colonia innesco PCR è un robusto, metodo di high-throughput per identificare il sito di inserimento trasposoni per ogni mutante. Questo approccio deriva da un tipico protocollo nested PCR ma qui un singolo innesco ibrida specificamente e / o non specifico per il DNA template seconda della rigorosità della temperatura di ricottura (Figura 1A). I prodotti tipici di PCR costituiti da più frammenti di DNA, la maggior parte dei quali sono specifici (Figura 1B). L&#39;uso di un diverso Primer di sequenziamento che annealing proprio a monte della ITR trasposone, ed a valle della sequenza riconosciuta da primer di amplificazione prevede specificità per la fase di sequenziamento (Figura 1C). Software automatizzato per l&#39;analisi di sequenza allinea le sequenze ottenute al genoma Coxiella fornendo il luogo esatto di inserzione di trasposoni (Figura 1C). Tutti inserzione di trasposoni possono essere quindi annotated sul genoma Coxiella (Figura 1D). Ogni mutante Coxiella è isolata e amplificata in condizioni asettiche in ACCM-2 di media prima di uno stoccaggio o di screening. La Figura 2 illustra un esempio di 38 mutanti di trasposoni in 16 punti / ICM geni Coxiella (Figura 2A). Per valutare la fattibilità di mutanti Coxiella, curve di crescita axeniche sono ottenute campionando colture batteriche per 7 giorni post-inoculazione e l&#39;applicazione del test di concentrazione batterica descritto in 1.5 (Figurie 2B). Mutanti amplificati vengono poi incubate con cellule epiteliali, in triplicato piastre a 96 pozzetti per 7 giorni. Tutti i mutanti Coxiella generati essendo GFP-tag, curve di crescita intracellulari sono ottenute misurando l&#39;intensità di fluorescenza GFP di ogni pozzetto, ogni 24 ore, e riportando i valori misurati in funzione del tempo (Figura 2C). Intrcurve di crescita acellulari forniscono analisi quantitativa dei fenotipi associati con ogni inserimento trasposoni nel genoma Coxiella. Per aggiungere informazioni qualitative sugli stessi mutanti di trasposoni, abbiamo optato per l&#39;acquisizione automatica delle immagini e analisi. Sette giorni dopo l&#39;infezione, le piastre sono fissate, trasformati per immunofluorescenza come descritto in 4 e analizzati utilizzando un processo automatizzato, microscopio a epifluorescenza come descritto nella 5. immagine automatica software di analisi come CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) elabora i canali acquisiti oggetti per analisi comparative (figura 3) in modo indipendente e segmenti identificati. Questo consente l&#39;identificazione e la caratterizzazione morfologica dei nuclei ospitanti cellulari, contorni di cellule, lisosomi e Coxiella colonie (Figura 3 pannelli superiori). Correlazione colonie Coxiella con le cellule ei lisosomi permette ai Identificatisu e specifiche analisi morfologica di Coxiella vacuoli -non (che sono LAMP1 positivi, Figura 3 pannello in basso a sinistra). Correlazione colonie Coxiella con contorni della cellula ospite consente l&#39;identificazione e specifica analisi morfologica delle cellule infette (Figura 3 pannello in basso al centro). Infine, i 4 canali vengono uniti per scopi di controllo qualità illustrazione e (Figura 3 in basso pannello di destra). I dati ottenuti da analisi delle immagini automatizzata possono essere tracciati uno contro l&#39;altro per ottenere &quot;grafici a dispersione multi-fenotipiche&quot;. Come esempio, nella Figura 4A zona media (in micron 2) di colonie Coxiella è tracciata contro il numero di colonie per cella (Figura 4A), al fine di identificare mutazioni che influenzano la replicazione intracellulare di Coxiella (replica fenotipo) e / o la capacità dei batteri di invadere le cellule ospiti (internalization fenotipo). L&#39;analisi statistica è stata usata per definire le regioni nel risultante grafico a dispersione corrispondente a lievi (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenotipi. Mutanti sono stati osservati in 3 gruppi principali: le mutazioni che hanno determinato una crescita intracellulare difettoso di Coxiella sono stati raggruppati nella parte più a sinistra del grafico (Figura 4A, puntini rosa e rosso); mutazioni che hanno interessato Coxiella internalizzazione nelle cellule sono state raggruppate nella parte inferiore del grafico (Figura 4A, blu chiaro e scuro punti) e, infine, i punti verdi nella regione più a destra della trama corrisponde a mutazioni conseguente fenotipi non significativi ( Z-score&gt; -2). È importante sottolineare che, mutanti che non riescono a replicare, ma sono ancora in grado di invadere le cellule ospiti, vengono rilevati dopo 7 giorni di infezione da batteri singoli o piccole colonie, adiacente ad ospitare nuclei delle cellule (Figura 4C, secondo pannello). Pertanto, la dimensione di Coxiella colo &quot;Nies &quot;sarà influenzato in modo significativo, ma il numero delle cellule infette non varierà rispetto alle cellule -infected WT Coxiella. Al contrario, le mutazioni che influenzano la capacità di Coxiella di invadere cellule ospiti determinano una diminuzione del numero di colonie / cellule. Quando questo numero è significativamente inferiore a 1, indica che, in media, vi è una diminuzione del numero complessivo di cellule infette. In alternativa, l&#39;area media (in micron 2) delle colonie Coxiella può essere tracciata contro il numero di cellule ospiti sopravvissute infezione (Figura 4B), per identificare mutazioni che conferiscono citotossicità di Coxiella (fenotipo citotossico). Come sopra, l&#39;analisi statistica è stata usata per definire le regioni nel risultante grafico a dispersione corrispondente a lievi (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenotipi. La maggior parte screening mutazioni non ha influenzato in modo significativo la sopravvivenza delle cellule, indipendentemente replicazione batterica all&#39;interno di hostcellule (punti verdi Figura 3B). 37 mutazioni sopravvivenza della cellula ospite forma lieve (Figura 3B, punti luce rossa), e 7 mutazioni erano particolarmente dannoso per ospitare sopravvivenza cellulare (figura 3B, puntini rossi scuri). Si noti che i parametri addizionali ottenute dall&#39;immagine procedura di analisi automatica possono essere usate per derivare altri grafici, a seconda delle esigenze sperimentali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Sequencing e annotazione di Coxiella mutanti di trasposoni (A) primer colonia singola PCR è usato per amplificare frammenti di DNA contenenti il sito di inserimento trasposoni. Un primer di amplificazione (Amp) è utilizzato sia come primer specifici e non specifici a seconda della rigorosità della temperatura di ricottura. (B) Tipico risultato di singola colonia di primer PCR. Ogni riattisu produce una serie di frammenti di dimensioni variabili, alcune delle quali contengono il sito di inserzione trasposone; alcuni altri sono amplificati casualmente come sottoprodotti della bassa stringenza ciclo PCR. (C) L&#39;uso di un primer di sequenziamento (Seq) che ibridizza alla sequenza trasposone permette il sequenziamento dei frammenti di interesse. Software (D) Le analisi della sequenza consente l&#39;annotazione automatica di inserzione di trasposoni sul genoma batterico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Axeniche e la crescita intracellulare di Coxiella mutanti di trasposoni (A) Nella schermata pilota, abbiamo isolato, sequenziato e proiettato 38 mutanti di trasposoni in 16 nucleo gEnes del sistema di secrezione dot / ICM Coxiella (indicati in rosso). (B) Al fine di valutare la fattibilità di ogni mutante trasposoni, la crescita di ogni isolare in terreno di coltura axeniche viene monitorata in 8 giorni utilizzando una fluorescenza tagged agente intercalante del DNA. (C) Ogni mutante viene quindi utilizzato per infettare cellule epiteliali. Come il trasposone possiede una cassetta GFP, la crescita batterica intracellulare è monitorato oltre 7 giorni di infezione, seguendo le variazioni di fluorescenza GFP associata con la replica Coxiella, usando un lettore per micropiastre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: analisi delle immagini automatizzata delle infezioni Coxiella Un auto.microscopio a epifluorescenza accoppiate viene utilizzato per l&#39;immagine di 21 posizioni per pozzetto di triplicato piastre da 96 pozzetti. I segmenti software di analisi dell&#39;immagine oggetti in ogni canali acquisiti per la quantificazione e analisi. In tutti i casi, sono esclusi oggetti toccano il bordo delle immagini. (A) Il canale Hoechst è utilizzato per identificare i nuclei della cellula ospite (cerchiato in verde). (B) Questi sono usati come semi per identificare contorni della cellula ospite nel canale Cy3 (la posizione dei nuclei è cerchiato in blu, contorni cellulari sono in verde). (C) Il canale Cy5 è utilizzato per identificare compartimenti LAMPADA1-positive (cerchiato in verde); solo gli oggetti inclusi nei contorni di cellule individuate in precedenza (in rosso) sono conservati per l&#39;analisi delle immagini. (D) Il canale GFP viene utilizzato per identificare colonie Coxiella (cerchiato in verde). (E) Correlazione colonie Coxiella con scomparti LAMPADA1 positivo permette l&#39;identificazione di Coxiella </em&gt; vacuoli -contenenti (CCV); solo gli oggetti inclusi nei contorni di cellule individuate in precedenza (in verde) sono conservati per l&#39;analisi delle immagini. (F) Correlazione colonie Coxiella con contorni cellulari permette l&#39;identificazione delle cellule infette (pseudocolored). (G) Le immagini acquisite nei 4 canali di fluorescenza (corrispondente a colonie Coxiella (verde), nuclei delle cellule ospite (blu), membrana plasmatica della cellula ospite (grigio), compartimenti LAMPADA1-positivo (rosso)) vengono fuse e utilizzata per l&#39;illustrazione e la qualità controllo. Scala bar 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: identificazione su larga scala dei fattori coinvolti nella Coxiella host / patogeno interagisconoioni. (A) La superficie media (in micron 2) di colonie Coxiella è tracciata contro il numero relativo di colonie per cella, per identificare replica e internalizzazione fenotipi di interesse. Punti verdi rappresentano fenotipi che si discostano da WT coxiella da un Z-score&gt; -2 (non significativo). Rosa e puntini blu rappresentano replica e internazionalizzazione fenotipi, rispettivamente, con un Z-score tra -2 e -4 (fenotipi lievi). Rosso e puntini blu scuro rappresentano fenotipi con Z-score ≤ -4 (fenotipi forti). (B) La superficie media (in micron 2) delle colonie Coxiella è stata tracciata contro il numero totale di cellule infettate (e non infetti) sopravvissute 7 giorni di infezione per valutare l&#39;effetto citotossico risultante dalla inserzione di trasposoni. Punti verdi rappresentano fenotipi che si discostano da WT coxiella da un Z-score&gt; -2 (non significativo). Puntini rosa rappresentano citotossico phenotypes con Z-score tra -2 e -4 (fenotipi lievi). I punti rossi rappresentano fenotipi citotossici con Z-score ≤ -4 (fenotipi forti). Le frecce indicano mutanti illustrate dal corrispondente lettera minuscola in C. (C) Immagini rappresentative della replica, internalizzazione e fenotipi citotossici. In tutti i casi, i nuclei delle cellule ospiti sono in rosso, colonie Coxiella sono in verde. Scala bar 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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