Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Studiet av vert / patogen interaksjoner har vist seg å være en bemerkelsesverdig måte å forstå bakterielle infeksjoner og utvikle alternative strategier for å motvirke smittsomme sykdommer. Men på grunn av mangfoldet av strategier utarbeidet av forskjellige bakterielle patogener, identifisering og karakterisering av bakteriell virulens faktorer og av verten signalveier som er rettet ved infeksjoner, representerer en virkelig utfordring. Dette krever utvikling av nye metoder for storskala identifisering av viktige vert / patogen interaksjon huber. Den siste utviklingen av innovative, høy gjennomstrømming og høy innholdsscreeningteknikker representerer en uvurderlig ressurs som kan tilpasses til studiet av intracellulære bakterielle patogener 15. Her har vi brukt den zoonotisk bakterie patogen Coxiella burnetii som modell for å utvikle screening tilnærminger som kombinerer transposon mutagenese og fluorescens-basert analyser. Importantly, gjør dette screening metoden samtidig overvåking av flere trinn av Coxiella intracellulære syklus, og gir en global oversikt over de strategier utviklet av denne bakterien å invadere, replikere og vedvare i infiserte celler. Den metode som er beskrevet her, er basert på to veletablerte teknikker, transposon-mutagenese og fluorescens-baserte analyser, noe som har blitt brukt til studiet av bakterielle patogener. Ved å kombinere disse teknikkene i sammenheng med høy gjennomstrømming / høyt innhold av skjermer gjør det mulig å evaluere effektene av et høyt antall av bakterielle mutasjoner ved å analysere et meget høyt antall hendelser (typisk 15 000 infiserte celler per bakterie mutasjoner blir avbildet og analysert). Dette gir et viktig statistisk analyse av hendelser som bakteriell invasjon av vertsceller og intracellulær replikering, som er, av natur, utsatt for høy variabilitet. Det er viktig å merke seg at andre cellelinjer enn epithelial kan anvendes for denne type screening. Imidlertid flate og store epitelceller er optimale for bildeanalyse som vertscelleorganeller, er lettere å oppdage. Fordi flertallet av automatiserte mikroskoper kan automatisk håndtere et stort antall plater, det er nesten ingen grenser for antall mutanter som kan bli vist samtidig. Avhengig av patogen, kan brukeren rettighet bruk av en epifluorescens eller et konfokalt mikroskop. Tidspunktet for bildeopptak vil for det meste avhenge av følsomheten av mikroskopet kameraet på antall felter ervervet per brønn, og på antall kanaler ervervet pr synsfelt. Brukeren kan bestemme hvordan du vil justere disse faktorene for å optimalisere screening-protokollen. Som et eksempel, avbildes vi en 96-brønns plate / time ved hjelp av de betingelser som er angitt i punkt 5.1. Bildeanalyse stor grad avhenger av maskinen (eller klynge av maskiner) benyttes. Vi bruker en 12-core (2 x 3.06 GHz 6-Core), 48 GB RAM arbeidsstasjon. Denne maskinen krever approxilag 40 min å analysere bilder ervervet fra en plate. Et viktig aspekt som må tas i betraktning ved utvikling av disse analyser er det satt opp av ny (eller optimaliseringen av eksisterende) protokoller for å tillate manipulering og behandling av et stort antall prøver. Et typisk eksempel er utviklingen av en enkelt koloni PCR primer tilnærming, som tillot oss å forsterke og hurtig rekkefølge Coxiella DNA-fragmenter som inneholder stedet for innsetting av hvert transposon, fra meget små prøver. Basert på vår erfaring, har high-fidelity polymerase å være nøye utvalgt og testet for å oppnå reproduserbare resultater. Den eneste begrensning av denne tilnærmingen kan gjemme seg i den observasjon at, i de fleste tilfeller omtrent 30% av de behandlede prøvene er ikke utnyttes, enten på grunn av PCR eller sekvenseringsfremgangsmåten. Men tatt i betraktning at isoleringen av nye Coxiella transposon-mutanter er ikke et hastighetsbegrensende trinn, er dette ikke represendte et stort problem. Likeledes er utviklingen av en pålitelig analyse for å kvantifisere bakteriekonsentrasjon av mutante varelageret nøkkel for denne tilnærmingen. På grunn av tendensen til å aggregere Coxiella når i suspensjon, er bruken av optiske tetthetsavlesninger ikke anvendelig for å beregne konsentrasjonen av Coxiella kulturer og den eneste eksisterende alternativ var kvantitativ PCR (qPCR). Her, ved bruk av en fluorescerende merket DNA-interkalerende middel betydelig fremskyndet bakterier kvantifisering. Denne fremgangsmåten kan også dra nytte av anvendelse av stabile cellelinjer som uttrykker fluorescerende markører for flere intracellulære avhengig av patogenet som brukes. Et annet viktig aspekt er anvendelse av cellekulturmedier blottet for fenolrødt. Vi observerte at denne pH-indikator har en naturlig fluorescens spenner den røde og grønne spekteret som metter signal registreres på den automatiserte fluorescens leseren. THan strategi presenteres her er avhengig av tilfeldig transposon mutagenese. For mutantene av interesse, anbefaler vi å validere unike trans (og klonalitet) ved hjelp av Southern blot og PCR presiseringer av transposoninsersjon nettstedet. Foruten utstyret som er beskrevet i protokollen delen, lag interessert i å bruke screening tilnærmingen presenteres her, vil ta stor fordel i oppsettet av en relasjonsdatabase for datainnsamling, en server for datalagring og en arbeidsstasjon for rask bildeanalyse. Viktigere er fremgangsmåten som her er beskrevet er egnet for studier av andre intracellulære bakterielle patogener gitt et tilfeldig mutagenese metode finnes for patogenet, kan cellelinjer bli smittet av organismen, og dette viser en bestemt fenotype ved infeksjon.

De framvoksende, endemisk bakterien Coxiella burnetii er ansvarlig for store utbrudd av Q-feber, en ødeleggende influensalignende zoonose med alvorlig helse og økonomiske konsekvensene en. De viktigste reservoarer av Coxiella er innenlands og husdyr, og det er anslått at mer enn 90% av melkekyr i USA bære C. burnetii to. Mennesker er tilfeldige verter som er infisert ved innånding av forurenset aerosoler. Humant Q-feber manifesterer enten som en akutt eller kronisk sykdom, noe som kan ha fatale komplikasjoner med en dødelighet nådde 65% 1,3. Med en infeksiøs dose på 1 - 10 organismer, er Coxiella den mest smittsomme organismen kjent, og det er blitt undersøkt som en potensiell biologisk våpen 4. Den nylige eksplosive utbrudd av Q-feber i Nederland (2007 - 2010), med saker økende fra 182 til mer enn 2000 per år, står som et eksempel på alvorlig virulens dette patogenet5. Den bemerkelsesverdige effektivitet av Coxiella infeksjoner er sannsynligvis forbundet med sin motstand mot miljømessig stress, kombinert med sin unike tilpasning til vertsceller. Faktisk er Coxiella tilstede i miljøet i form av metabolsk inaktive små cellevariantene (SCV), som er bemerkelsesverdig motstandsdyktige mot flere barske forhold (uttørking, temperatur, etc.). Hydraulikkventiler er opp tatt av fagocyttceller via α V β 3 inte 6 mens invasjonen av ikke-fagocyttceller medieres av Coxiella adhesjon / invasjon OmpA 7 og en ennå uidentifiserte reseptor. Etter opptaket, bosatt Coxiella i tettsittende vakuoler, positive for tidlig endosomale markører Rab5 og EEA1 8. Bakterier svare på endosomale forsuring ved å konvertere til metabolsk aktive store celle varianter (varebiler) og aktivere en Dot / Icm type 4 sekresjon system (T4SS) 9, Meget homologe med den i Legionella pneumophila 10. Utskillelsen av Dot / ICM effektorer tillate Coxiella å generere et stort, LAMP1-positive surt rommet inneholder aktive lysosomale enzymer hvor bakterier kan trives og aktivt beskytter infiserte celler fra apoptose 11. Derfor er den intracellulære syklus av Coxiella styres av Dot / Icm-mediert translokasjon av bakterielle effektorer 12 imidlertid den mikrobielle faktorer involvert i vertscellen invasjon, bakteriell replikasjon og spredning av infeksjonen forblir stort sett ukjent. Kombinere transposon mutagenese og fluorescens-baserte analyser, utvikler vi objektive tilnærminger for samtidig identifisering av bakterielle faktorer involvert i de viktigste trinnene i Coxiella infeksjoner: 1) internalisering innenfor vertsceller, 2) intracellulær replikering, 3) celle-til-celle spredning og 4) utholdenhet. Hittil har vi vist over 1000 mutations i 500 Coxiella sekvenser, som ga oss med enestående innsikt i verts-patogen interaksjoner som regulerer Coxiella patogenesen 7. Av notatet, kan denne tilnærmingen brukes til studier av andre intracellulære patogener som deler cellebiologiske funksjoner med Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasjon og koloniseringen av vertcellene med bakterielle patogener avhenge av aktiviteten av et stort antall prokaryote proteiner, definert som virulensfaktorer, som kan undergrave og manipulere sentrale vertsfunksjonene. Studiet av vert / patogen interaksjoner er derfor svært viktig å forstå bakterielle infeksjoner og utvikle alternative strategier for å motvirke smittsomme sykdommer. Denne fremgangsmåten krever imidlertid utvikling av nye high-throughput-analyser for objektiv, automatisert identifisering og karakterisering av bakterielle virulens-determinanter. Her beskriver vi en fremgangsmåte for generering av et GFP-merket mutant-biblioteket ved transposon-mutagenese og utvikling av høyt innhold screening tilnærminger for samtidig identifikasjon av flere transposon-assosiert fenotyper. Vår arbeidsmodell er den intracellulære bakterielle patogenet Coxiella burnetii, det etiologiske middel av den zoonosis Q-feber, som er forbundet med seg selvvere utbrudd med en påfølgende helse og økonomisk byrde. Den obligat intracellulære natur dette patogenet har, inntil nylig, sterkt hemmet identifisering av bakterielle faktorer involvert i verts patogen interaksjoner, noe av Coxiella den ideelle modellen for gjennomføring av high-throughput / høyt innhold tilnærminger.

Ved isolering av transposon mutanter, er singel primer koloni PCR en robust, high-throughput metode for å identifisere stedet av transposoninsersjon for hver mutant. Denne tilnærmingen stammer fra en typisk nestet PCR-protokollen, men her en enkelt primer hybridiserer spesifikt og / eller ikke-spesifikt til templat-DNA, avhengig av stringensen av glødetemperaturen (figur 1A). Den typiske PCR-produkter består av flere DNA-fragmenter, hvorav de fleste er bestemt (figur 1B). Bruken av en annen sekvense primer som hybridiserer rett oppstrøms av transposonet ITR, og nedstrøms av sekvensen gjenkjent av amplifikasjonsprimer gir spesifisitet for sekvensering trinn (figur 1C). Automatisert programvare for sekvensanalyse justerer innhentet sekvenser til Coxiella genomet gir nøyaktig åsted for transposon innsett (figur 1C). Alle transposon innsett kan være så annotated på Coxiella genomet (figur 1D). Hver Coxiella mutant er isolert og amplifisert axenically i ACCM-2 medium enten før lagring eller screening. Figur 2 illustrerer et eksempel på 38 transposon-mutanter i 16 punkter / ICM Coxiella gener (figur 2A). For å vurdere levedyktigheten til Coxiella mutanter, er axenic vekstkurver oppnådd ved prøvetaking bakteriekulturer i 7 dager etter inokulering, og påføring av bakteriekonsentrasjon analysen beskrevet i 1.5 (Figurie 2B). Amplifiserte mutanter blir deretter inkubert med epitelceller, i triplikate 96-brønners plater i 7 dager. Alle Coxiella mutanter som genereres blir GFP-merket, blir intracellulære vekstkurver oppnådd ved å måle GFP fluorescensintensiteten til hver brønn, hver 24. time, og plotte de målte verdiene som en funksjon av tid (figur 2C). Intracellulære vekstkurver gi kvantitativ analyse av fenotypene assosiert med hvert transposon innsetting i Coxiella genomet. For å legge til kvalitativ informasjon om de samme transposon mutanter, vi har valgt for automatisert bilde oppkjøpet og analyse. Syv dager etter infeksjon, platene er løst, behandlet for immunfluorescens som beskrevet i fire og analysert ved hjelp av en automatisert, epifluorescence mikroskop som beskrevet i 5. Automatisert bildeanalyse programvare som CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) behandler de oppkjøpte kanaler selvstendig og segmentene identifiseres objekter for komparativ analyse (figur 3). Dette gjør at identifisering og morfologiske karakterisering av vertscellekjerner, celle konturer, lysosomer og Coxiella kolonier (figur 3 øverste panelene). Korrelere Coxiella kolonier med celler og lysosomene tillater identifikasjonpå og bestemt morfologisk analyse av Coxiella holdige vakuoler (som er LAMP1 positive, Figur 3 nedre venstre panel). Korrelere Coxiella kolonier med vertscelle konturer gjør identifisering og spesifikk morfologisk analyse av infiserte celler (figur 3 nederst i midten panel). Til slutt blir de fire kanalene slått sammen for illustrasjon og kvalitetskontroll (figur 3 nederst til høyre panel). Data innhentet fra automatisert bildeanalyse kan plottes mot hverandre for å oppnå &quot;multi-fenotypiske spredningsplott&quot;. Som et eksempel er på figur 4A gjennomsnittlig areal (i mikrometer 2) av Coxiella kolonier plottet mot antall kolonier per celle (figur 4A), for å identifisere mutasjoner som påvirker intracellulær replikasjon av Coxiella (replikasjon fenotype) og / eller kapasiteten av bakterier for å invadere vertsceller (internalization fenotype). Statistisk analyse ble brukt for å definere områder i den resulterende punktplott tilsvarende milde (-4 &lt;Z-score ≤ -2) og alvorlig (Z-score ≤ -4) fenotyper. Mutantene ble observert i tre hoved klynger: mutasjoner som resulterte i en defekt intracellulær vekst av Coxiella ble gruppert i venstre meste av tomten (Figur 4A, rosa og røde prikker); mutasjoner som påvirket Coxiella intern i celler ble gruppert i den nederste delen av tomten (Figur 4A, lys og mørk blå prikker) og til slutt, grønne prikker i lengst til høyre region av tomten tilsvarer mutasjoner som resulterer i ikke-signifikante fenotyper ( Z-score&gt; -2). Viktigere, mutanter som ikke klarer å gjenskape, men er fortsatt i stand til å invadere vertsceller, blir oppdaget etter 7 dager på infeksjon som enkelt bakterier, eller små kolonier, som grenser til å være vert cellekjerner (Figur 4C, andre panel). Derfor er størrelsen av Coxiella &quot;Coloskapene &quot;vil bli vesentlig påvirket, men antallet infiserte celler vil ikke variere sammenlignet med WT Coxiella -infected celler. Tvert imot, mutasjoner som påvirker kapasiteten Coxiella å invadere vertsceller resulterer i en reduksjon i antall kolonier / celle. Når denne verdien er betydelig under en, indikerer det at det i gjennomsnitt er en reduksjon i det totale antall infiserte celler. Alternativt kan den gjennomsnittlige området (i mikrometer 2) av Coxiella kolonier bli plottet mot antall vertsceller overlever infeksjon (figur 4B), for å identifisere mutasjoner som cytotoksisitet til Coxiella (cytotoksisk fenotype). Som ovenfor, ble statistisk analyse brukes for å definere områder i den resulterende punktplott tilsvarende milde (-4 &lt;Z-score ≤ -2) og alvorlig (Z-score ≤ -4) fenotyper. Mest skjermet mutasjoner hadde ingen betydelig innvirkning celle overlevelse, uavhengig av bakteriell replikasjon i vertsceller (Figur 3B grønne prikker). 37 mutasjoner lett affisert vertscelleoverlevelse (Figur 3B, lyse røde prikker), og 7 mutasjoner var spesielt skadelig å være vert for celle overlevelse (figur 3B, mørke røde prikker). Vær oppmerksom på at flere parametere som oppnås ved den automatiserte bildeanalyseprosedyre kan benyttes til å utlede andre diagrammer, i henhold til eksperimentelle behov. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figur 1:. Sequencing og annotering av Coxiella transposon mutanter (A) Enkelt primer koloni PCR brukes til å forsterke DNA-fragmenter som inneholder stedet transposoninsersjon. En amplifikasjonsprimer (Amp) brukes både som en spesifikk og ikke-spesifikk primer avhengig av stringensen av glødetemperatur. (B) Typisk resultat av enkelt primer koloni PCR. Hver Reactipå produserer en rekke fragmenter av variabel størrelse, hvorav noen inneholder transposonet innføringsstedet; noen andre er tilfeldig forsterket som biprodukter av lav stringens PCR-syklus. (C) Bruk av en sekvense primer (Seq) som hybridiserer til transposonet sekvensen tillater sekvensering av fragmentene av interesse. (D) Sekvens analyse programvare tillater automatisk annotering av transposon innsett på bakteriegenomet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Fig. 2: Axenic og intracellulær vekst av Coxiella transposon-mutanter (A) I pilotskjermen, har vi isolert, sekvensert og vist 38 transposon-mutanter i 16 kjerne gEnes av Coxiella punkter / ICM sekresjon system (angitt i rødt). (B) For å vurdere levedyktigheten til hvert transposon mutant, veksten av hvert isolat i axenic kulturmediet overvåkes i løpet av 8 dager ved hjelp av et fluorescens-merket DNA-interkalerende middel. (C) hver mutant blir deretter anvendt for å infisere epitelceller. Som transposonet besitter en GFP kassett, er intracellulær bakterievekst overvåkes over 7 dager etter smitte ved å følge varianter av GFP fluorescens forbundet med Coxiella replikering, ved hjelp av en mikroplateleser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figur 3: Automatisert bildeanalyse av Coxiella infeksjoner An auto.parret epifluorescens mikroskop brukes til å avbilde posisjonene 21 per brønn i triplikat 96-brønners plater. De bildeanalyse programvare segmenter objekter i hver kjøpt kanaler for kvantifisering og analyse. I alle tilfeller, blir objektene berører kanten av bildene utelukket. (A) Hoechst-kanalen brukes til å identifisere vertscellekjerner (markert med grønt). (B) Disse brukes som frø for å identifisere vertscelle konturer i Cy3 kanal (posisjon kjerner er sirkel i blått, celle konturer er i grønt). (C) Den Cy5 kanalen brukes til å identifisere LAMP1-positive avdelinger (innringet i grønt); bare de objektene som inngår i de tidligere identifiserte celle konturer (i rødt) blir beholdt til bildeanalyse. (D) Den GFP-kanalen brukes til å identifisere Coxiella kolonier (markert med grønt). (E) Korrelere Coxiella kolonier med LAMP1-positive avdelinger tillater identifisering av Coxiella </em&gt; holdige vakuoler (CCVs); bare de objektene som inngår i de tidligere identifiserte celle konturer (i grønt) blir beholdt til bildeanalyse. (F) Korrelere Coxiella kolonier med celle konturer gjør identifisering av infiserte celler (pseudocolored). (G) Bilder ervervet i de 4 fluorescens kanaler (tilsvarende Coxiella kolonier (grønn), vertscellekjerner (blå), vertscellen plasmamembran (grå), LAMP1-positive avdelinger (rød)) er slått sammen og brukes til illustrasjon og kvalitet kontroll. Skala barer 10 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figur 4: Storskala identifisering av Coxiella faktorer involvert i vert / patogen samhandler-ioner. (A) Den gjennomsnittlige området (i mikrometer 2) av Coxiella kolonier er plottet mot den relative antall kolonier per celle, for å identifisere replikering og internalisering fenotyper av interesse. Grønne prikker representerer fenotyper som avviker fra WT Coxiella av en Z-score&gt; -2 (ikke signifikant). Rosa og lyseblå prikker representerer replikering og internalise fenotyper henholdsvis med en Z-score mellom -2 og -4 (mild fenotyper). Røde og mørke blå prikkene representerer fenotyper med Z-score ≤ -4 (sterke fenotyper). (B) Den gjennomsnittlige området (i mikrometer 2) av Coxiella kolonier ble plottet mot det totale antall celler (infiserte og ikke infiserte) som overlevde 7 dager etter infeksjon for å estimere den cytotoksiske virkning som følge av transposon innsettinger. Grønne prikker representerer fenotyper som avviker fra WT Coxiella av en Z-score&gt; -2 (ikke signifikant). Rosa prikker representerer cytotoksiske phenotypes med en Z-score mellom -2 og -4 (mild fenotyper). Røde prikker representerer cytotoksiske fenotyper med Z-score ≤ -4 (sterke fenotyper). Pilene viser mutanter illustrert av den tilsvarende liten bokstav i C. (C) Representative bilder av replikering, intern og cytotoksiske fenotyper. I alle tilfeller, vertscellekjerner er i rødt, Coxiella koloniene er i grønt. Skala barer 50 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii er en obligat intracellulær Gram-negative bakterien ansvarlig for zoonotisk sykdom Q-feber. Her beskriver vi fremgangsmåter for generering av Coxiella fluorescerende transposon-mutanter så vel som automatisk identifisering og analyse av de resulterende internalisering, replikering og cytotoksiske fenotyper.

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En Screeningsteknikken å isolere Toxoplasma gondii Host-celle Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Tilrettelegging Drug Discovery: En automatisert høyt innhold Betennelse Assay i sebrafisk

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analyse for kvantifisering av intracellulær mykobakterier tilpasset høygjennomstrømning / screening av høyt innhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifisering av nye gener assosiert med Alginat Produksjonen i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Ved hjelp av Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner transposon-mediert Mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvikling av lyofilisert Loop-mediert Isotermiske amplifiseringsreagenser for deteksjon av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Bruk av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for å undersøke Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA lyddemping

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Høy gjennomstrømming parallelle sekvensering å måle Fitness Leptospira interrogans Transposon innsetting mutanter under Golden Syrian Hamster infeksjon

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av bestilt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa belastning PA14 Transposon innsetting mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuelle og mikroskopiske evaluering av Streptomyces utviklingsmessige mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...