Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Изучение хост / патогена взаимодействия оказалась замечательным способом понять бактериальных инфекций и развивать альтернативные стратегии по борьбе с инфекционными заболеваниями. Тем не менее, из-за разнообразия стратегий, разработанных различными бактериальными патогенами, идентификация и характеристика бактериальных факторов вирулентности и хозяина сигнальных путей, которые целевой при инфекциях представляют собой реальную проблему. Это требует разработки новых подходов к крупномасштабной идентификации ключевых узлов взаимодействия хоста / патогена. Недавнее развитие инновационной, высокой пропускной и высокого содержания методов скрининга представляет собой бесценный ресурс, который может быть адаптирован к изучению внутриклеточных бактериальных патогенов 15. Здесь мы использовали зоонозных бактериальный возбудитель Coxiella burnetii в качестве модели для разработки скрининга подходы, которые сочетают транспозонов мутагенеза и флуоресценции на основе анализов. ImportanTLY, этот метод скрининга позволяет одновременный мониторинг нескольких шагах внутриклеточного цикла Coxiella, обеспечивая глобальный обзор стратегий, разработанных этой бактерией вторгнуться, тиражировать и сохраняются в течение инфицированных клеток. Описанный здесь подход основан на двух хорошо известных методов, транспозонов мутагенеза и флуоресценции основе анализа, которые были успешно применены к изучению бактериальных патогенов. Сочетание этих методов в контексте экранов высокой пропускной / высокого содержания позволяет оценить воздействие большого количества бактериальных мутаций, анализируя очень большое количество событий (обычно 15000 инфицированных клеток за бактериальных мутаций вошедшие и анализируются). Это обеспечивает важную статистический анализ событий, таких как бактериальной инвазии клеток-хозяев и внутриклеточного репликации, которые, по своей природе, с учетом высокой изменчивости. Важно отметить, что другие клеточные линии, чем ЕРithelial могут быть использованы для этого типа скрининга. Тем не менее, плоские и большие эпителиальные клетки являются оптимальными для анализа изображений, как хост клеточные органеллы легче обнаружить. Поскольку большинство автоматизированных микроскопов может автоматически обрабатывать большое количество пластин, не существует практически никаких ограничений на количество мутантов, которые могут быть подвергнуты скринингу одновременно. В зависимости от возбудителя, пользователь может привилегия использование эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии. Время получения изображения во многом будет зависеть от чувствительности камеры микроскопа, от количества полей, полученных на лунку и по количеству каналов, полученных в поле зрения. Пользователь может решить, как корректировать эти факторы для оптимизации протокола скрининга. В качестве примера, мы отображаемого один 96-луночного планшета / ч с использованием условий, указанных в пункте 5.1. Анализ изображения значительной степени зависит от машины (или группе машин) используется. Мы используем 12-ядро (2 х 3,06 ГГц 6-Core), 48 ГБ оперативной памяти рабочей станции. Эта машина требует Approxiсчете 40 мин для анализа изображений, полученных с одной пластины. Важный аспект необходимо учитывать при разработке этих анализов является множество из новых (или оптимизации существующих протоколов), чтобы позволить манипуляцию и обработку большого числа образцов. Типичным примером является развитие единого грунт колонии ПЦР подхода, который позволил нам быстро усилить и фрагменты последовательности Coxiella ДНК, содержащие сайт вставки каждого транспозонов, от очень маленьких образцов. Основываясь на нашем опыте, высококачественный полимеразной должен быть тщательно отобраны и протестированы для того, чтобы получить воспроизводимые результаты. Единственное ограничение этого подхода может скрывать в наблюдении, что, в большинстве случаев, около 30% из полученных образцов не являются годный для использования, либо из-за ПЦР или шагов секвенирования. Однако, учитывая, что изоляция новых Coxiella транспозонов мутантов не ограничение скорости шаг, это не предстанаправил важный вопрос. Аналогичным образом, разработка надежного анализа количественного определения концентрации бактерий мутантных запасов играет ключевую роль в этом подходе. В связи с тенденцией к агрегации Coxiella, когда в суспензии, использование показаний оптической плотности не применяется для расчета концентрации Coxiella культур и единственной существующей альтернативой количественный ПЦР (КПЦР). Здесь использование флуоресцентно меченых ДНК интеркалирующего агента значительно ускорить бактерий количественное. Этот подход также может воспользоваться использованием стабильных клеточных линий, экспрессирующих флуоресцентные маркеры для нескольких внутриклеточные компартменты, в зависимости от возбудителя используется. Другим важным аспектом является использование клеточной культуральной среде, лишенной фенолового красного. Мы наблюдали, что этот показатель рН имеет естественную флуоресценцию охватывающей красный и зеленый спектр, который насыщает сигнала, записанного на автоматизированном считывания флуоресценции. Тон стратегия, представленная здесь опирается на случайный транспозонов мутагенеза. Для мутантов интерес, мы рекомендуем проверки уникальные перестановки (и клональности) с помощью Саузерн-блоттинга и ПЦР амплификации сайта вставки транспозона. Кроме оборудования, описанного в разделе протокола, команды, заинтересованные в использовании скрининга подход, представленный здесь, доставит огромное преимущество в заданной реляционной базы данных для сбора данных, сервер для хранения данных и рабочих станций для быстрого анализа изображений. Важно отметить, что метод здесь описано подходит для изучения других внутриклеточных бактериальных патогенов при условии случайного мутагенеза существует для возбудителя, клеточные линии могут быть заражены возбудителем, и это одна отображает определенный фенотип при заражении.

Emerging, эндемичных бактерия Coxiella burnetii несет ответственность за крупных вспышек лихорадки Ку, изнурительной гриппа, как зоонозов с тяжелой здоровья и экономического влияния 1. Основные резервуары Coxiella являются отечественные и животные, и, по оценкам, более 90% молочного скота в США несут С. burnetii 2. Люди случайные хозяева, которые заражены при вдыхании загрязненной аэрозолей. Человек лихорадка Ку проявляется либо в виде острого или хронического заболевания, которое может иметь фатальные осложнения с уровнем смертности достигает 65% 1,3. С инфекционного дозе 1 - 10 организмов, Coxiella наиболее инфекционного патогена известны и он был исследован в качестве потенциального биологического оружия 4. Недавнее взрывное вспышка лихорадки Ку в Нидерландах (2007 - 2010), с случаев эскалации от 182 до более чем 2000 год, стоит в качестве примера серьезного вирулентности патогена5. Примечательно, эффективность Coxiella инфекций, скорее всего, связано с его устойчивостью к экологическому стрессу, в сочетании с уникальной адаптации для размещения клеток. Действительно, Coxiella присутствует в окружающей среде в виде неактивных метаболически небольших вариантов клеток (SCV), которые удивительно устойчивы к нескольким суровых условиях (высыхания, температура и т.д.). КСМ которые принимаются до фагоцитирующих клеток с помощью α V β 3 интегринов 6, а вторжение без фагоцитирующих клеток при посредничестве Coxiella адгезии / инвазии OmpA 7 и еще неизвестному рецептора. После поглощения, Coxiella проживает в облегающие вакуолей, положительных на ранних маркеров эндосомных Rab5 и EEA1 8. Бактерии реагируют на подкисление эндосомный путем преобразования в метаболически активных крупных вариантов клеток (легких коммерческих автомобилей) и активации типа 4 системы секреции точка / ICM (T4SS) 9Высоко гомологичны, что легионелл 10. Секреция точка / ICM эффекторов позволяют Coxiella генерировать большой, ЛАМПА1-положительных кислой отсек, содержащий активные лизосомальные ферменты, где бактерии могут процветать и активно защищают инфицированные клетки от апоптоза 11. Следовательно, внутриклеточный цикл Coxiella контролируется Точка / ICM-опосредованной транслокации бактерий эффекторов 12, однако, микробные факторы, участвующие в инвазии клеток хозяина, бактериальной репликации и распространения инфекции остаются в значительной степени неизвестными. Сочетание транспозонов мутагенеза и флуоресценции на основе анализов, мы разрабатываем беспристрастные подходы для одновременной идентификации бактериальных факторов, участвующих в основных шагов Coxiella инфекций: 1) интернационализация в клетках-хозяевах, 2) внутриклеточный репликации, 3) спред от клетки к клетке и 4) сохранение. На сегодняшний день, мы скрининг более 1000 мutations в 500 кодирующих последовательностей Coxiella, которые предоставили нам беспрецедентные идеи в хозяин-патоген взаимодействий, которые регулируют Coxiella патогенеза 7. Следует отметить, что этот подход может быть применен к изучению других внутриклеточных патогенов, которые разделяют особенности клеточной биологии с Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Вторжение и колонизации клеток-хозяев бактериальными патогенами зависит от активности большого числа прокариотических белков, определяемой как факторов вирулентности, которые могут подорвать и манипулировать ключевые функции хоста. Изучение хост / патогена взаимодействия Поэтому крайне важно, чтобы понять, бактериальных инфекций и развивать альтернативные стратегии по борьбе с инфекционными заболеваниями. Этот подход, однако, требует разработки новых высокопроизводительных анализов для объективной, автоматизированной идентификации и характеризации бактериальных вирулентных детерминант. Здесь мы опишем метод для генерации GFP-тегами мутанта библиотеке транспозонов мутагенеза и развитие высокого содержания скрининга подходит для одновременного выявления нескольких транспозонов связанный фенотипов. Наша рабочая модель внутриклеточной бактериальный возбудитель Coxiella burnetii, этиологический агент зоонозов лихорадки Ку, который связан с SEВере вспышек с последующим здоровья и экономического бремени. Облигатные внутриклеточные природа этого патогена не имеет, до недавнего времени, сильно затруднено выявление бактериальных факторов, участвующих в хост патогена взаимодействия, изготовление Coxiella идеальную модель для реализации подходов с высокой пропускной / высоких контента.

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii это облигатные внутриклеточные грамотрицательные бактерии ответственны за зоонозных заболеваний лихорадкой Ку. Здесь мы опишем методы генерации Coxiella люминесцентные транспозонов мутантов, а также автоматической идентификации и анализа полученных интернализации, репликации и цитотоксических фенотипов.

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Генетические экрана изолировать Toxoplasma гондий Клетки-хозяина Мутанты Egress

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Содействие Drug Discovery: Автоматизированные высокого содержания воспаление Анализ в данио рерио

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Идентификация новых генов, ассоциированных с альгината производства в<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; Использование мини-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner транспозонов-опосредованного мутагенеза

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Во время миРНК Глушащий

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Высок объём параллельного секвенирования для измерения фитнес Лептоспире interrogans Transposon вставки мутантов во время Золотой сирийского хомяка инфекции

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Репликация Ordered, неизбыточной библиотека штамма PA14 Transposon вставки мутантов синегнойной палочки

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Визуальные и микроскопических оценки Streptomyces развития мутантов

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...