Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
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Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

El estudio de las interacciones huésped / patógeno ha demostrado ser un método notable de entender infecciones bacterianas y desarrollar estrategias alternativas para contrarrestar las enfermedades infecciosas. Sin embargo, debido a la diversidad de estrategias elaboradas por diferentes patógenos bacterianos, la identificación y caracterización de factores de virulencia bacterianos y del huésped vías de señalización que están dirigidos durante las infecciones representan un verdadero desafío. Esto requiere el desarrollo de nuevos enfoques para la identificación a gran escala de los centros principales de interacción huésped / patógeno. El reciente desarrollo de innovadores, de alto rendimiento y técnicas de selección de alto contenido representa un recurso muy valioso que se puede adaptar al estudio de patógenos bacterianos intracelulares 15. En este caso, hemos utilizado el zoonótica bacteriana Coxiella burnetii patógeno como modelo para desarrollar enfoques de cribado que combinan mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia. Importantly, este método de cribado permite la monitorización simultánea de múltiples pasos del ciclo intracelular Coxiella, proporcionando una visión global de las estrategias desarrolladas por esta bacteria invadir, replicarse y persistir en las células infectadas. El método descrito aquí se basa en dos técnicas bien establecidas, mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia, que se han aplicado con éxito para el estudio de patógenos bacterianos. La combinación de estas técnicas en el contexto de las pantallas de alto rendimiento / alto contenido nos permite evaluar los efectos de un elevado número de mutaciones bacterianas mediante el análisis de un número muy elevado de eventos (típicamente 15.000 células infectadas por mutaciones bacterianas son fotografiados y analizados). Esto proporciona un importante análisis estadístico de eventos tales como la invasión bacteriana de las células huésped y la replicación intracelular, que son, por naturaleza, sujetos a una alta variabilidad. Es importante tener en cuenta que las líneas celulares distintas de epithelial se puede utilizar para este tipo de cribado. Sin embargo, las células epiteliales planas y grandes son óptimas para análisis de imagen como orgánulos de la célula huésped son más fáciles de detectar. Debido a que la mayoría de los microscopios automatizados puede manejar automáticamente un gran número de platos, prácticamente no hay límites para el número de mutantes que se proyectará simultáneamente. Dependiendo del patógeno, la lata usuario privilegio el uso de un epifluorescencia o un microscopio confocal. El tiempo de adquisición de la imagen dependerá sobre todo de la sensibilidad de la cámara microscopio, en el número de campos adquiridos por pocillo y en el número de canales adquiridos por campo de visión. El usuario puede decidir cómo ajustar estos factores para optimizar el protocolo de cribado. Como ejemplo, tenemos fotografiado uno de 96 pocillos placa / hr utilizando las condiciones indicadas en el punto 5.1. Análisis de la imagen depende en gran medida de la máquina (o grupo de máquinas) que se utiliza. Utilizamos un 12 núcleos (2 x 3.06 GHz 6-Core), estación de trabajo de RAM 48 GB. Esta máquina requiere aproximadamente 40 minutos para analizar las imágenes adquiridas de una placa. Un aspecto importante a tener en cuenta en el desarrollo de estos ensayos es la puesta en marcha de nuevo (o la optimización de los existentes) protocolos para permitir la manipulación y el procesamiento de un gran número de muestras. Un ejemplo típico es el desarrollo del enfoque de PCR colonia único cebador, lo que nos permitió amplificar rápidamente y fragmentos de ADN Coxiella secuencia que contienen el sitio de inserción de cada transposón, desde muestras muy pequeñas. Basándonos en nuestra experiencia, la alta fidelidad de la polimerasa tiene que ser cuidadosamente seleccionados y probados a fin de obtener resultados reproducibles. La única limitación de este enfoque puede ocultar en la observación de que, en la mayoría de los casos, aproximadamente el 30% de las muestras procesadas no son explotables, ya sea debido a la PCR o los pasos de secuenciación. Sin embargo, teniendo en cuenta que el aislamiento de nuevos mutantes de transposón Coxiella no es un paso limitante de la velocidad, esto no repreenviado un problema importante. Del mismo modo, el desarrollo de un ensayo fiable para cuantificar la concentración bacteriana de las poblaciones de mutantes ha sido clave para este enfoque. Debido a la tendencia de Coxiella a agregarse cuando en suspensión, el uso de lecturas de densidad óptica no es aplicable para calcular la concentración de las culturas Coxiella y la única alternativa existente era PCR cuantitativa (qPCR). Aquí, el uso de un agente de intercalación de ADN marcado con fluorescencia aceleró significativamente bacterias cuantificación. Este enfoque también puede tomar ventaja de la utilización de líneas celulares estables que expresan marcadores fluorescentes para varios compartimentos intracelulares dependiendo del patógeno utilizado. Otro aspecto importante es el uso de medios de cultivo celular exento de rojo de fenol. Hemos observado que este indicador de pH tiene una fluorescencia natural que abarca el espectro rojo y verde que satura la señal grabada en el lector de fluorescencia automatizado. Tél estrategia que aquí se presenta se basa en la mutagénesis de transposones azar. Para los mutantes de interés, se recomienda validar transposiciones únicos (y clonalidad) mediante Southern blot y PCR amplificaciones de la zona de inserción del transposón. Además de los equipos descritos en la sección de protocolo, equipos interesados ​​en utilizar el enfoque de selección que aquí se presenta, se llevarán una gran ventaja en la puesta en marcha de una base de datos relacional para la recopilación de datos, un servidor de almacenamiento de datos y una estación de trabajo para el análisis de imágenes rápida. Es importante destacar que el método aquí descrito es adecuado para el estudio de otros patógenos bacterianos intracelulares siempre que exista un método de mutagénesis aleatoria para el patógeno, las líneas celulares pueden ser infectadas por el patógeno y éste muestra un fenotipo específico durante la infección.

La bacteria Coxiella burnetii endémica emergente es responsable de grandes brotes de fiebre Q, una zoonosis parecida a la gripe debilitante con la salud graves e impacto económico 1. Los principales reservorios de Coxiella son animales domésticos y de granja, y se estima que más del 90% de las vacas lecheras en los EE.UU. llevar C. burnetii 2. Los seres humanos son huéspedes accidentales que están infectados por inhalación de aerosoles contaminados. Fiebre Q humano se manifiesta ya sea como una enfermedad aguda o crónica, que puede tener complicaciones fatales con una tasa de mortalidad de llegar a 65% de 1,3. Con una dosis infecciosa de 1 - 10 organismos, Coxiella es el patógeno más infecciosa conocida y ha sido investigado como un arma potencial bio 4. El reciente brote explosivo de la fiebre Q en los Países Bajos (2007 - 2010), con casos crecientes de 182 a más de 2.000 por año, se erige como un ejemplo de la severa virulencia de este patógeno5. La notable eficacia de infecciones Coxiella probablemente se asocie con su resistencia al estrés ambiental, combinado con su adaptación única a las células huésped. De hecho, Coxiella está presente en el medio ambiente en forma de pequeñas variantes metabólicamente inactivos celulares (SCV), que son notablemente resistentes a varias condiciones duras (desecación, temperatura, etc.). SCVs son hasta tomada por las células fagocíticas a través de α V β 3 integrinas 6 mientras que la invasión de células no fagocíticas está mediada por la Coxiella adhesión / invasión OmpA 7 y un receptor aún no identificado. Tras la absorción, Coxiella reside en vacuolas ajustados, positivos para los marcadores endosomales primeros Rab5 y EEA1 8. Las bacterias responden a la acidificación endosomal convirtiendo a las variantes de células grandes metabólicamente activas (LCV) y la activación de un sistema de secreción tipo 4 Dot / ICM (T4SS) 9, Altamente homóloga a la de Legionella pneumophila 10. La secreción de efectores Dot / ICM permite Coxiella para generar un compartimento ácida gran LAMP1-positivo que contiene enzimas lisosomales activos donde las bacterias pueden prosperar y proteger activamente las células infectadas de la apoptosis 11. Por lo tanto, el ciclo intracelular de Coxiella es controlado por la translocación mediada por Icm Dot / de efectores bacterianos 12, sin embargo, los factores microbianos implicados en la invasión de células huésped, la replicación bacteriana y la difusión de la infección siguen siendo en gran medida desconocido. Combinando mutagénesis de transposones y ensayos basados ​​en fluorescencia, estamos desarrollando métodos imparciales para la identificación simultánea de factores bacterianos implicados en los pasos principales de infecciones Coxiella: 1) la internalización en las células huésped, 2) la replicación intracelular, 3) de propagación de célula a célula y 4) la persistencia. Hasta la fecha, hemos proyectado más de 1.000 mutations en 500 secuencias Coxiella codificación, que nos proporcionaron conocimientos sin precedentes en las interacciones huésped-patógeno que regulan Coxiella patogénesis 7. De nota, este enfoque puede ser aplicado al estudio de otros patógenos intracelulares que comparten características de biología celular con Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

La invasión y la colonización de las células huésped por patógenos bacterianos dependen de la actividad de un gran número de proteínas procariotas, definido como factores de virulencia, que puede subvertir y manipular las funciones de acogida clave. El estudio de las interacciones huésped / patógeno tanto, es extremadamente importante comprender las infecciones bacterianas y desarrollar estrategias alternativas para hacer frente a las enfermedades infecciosas. Este enfoque, sin embargo, requiere el desarrollo de nuevos ensayos de alto rendimiento para el, la identificación automatizada imparcial y caracterización de determinantes de virulencia bacteriana. A continuación, describimos un método para la generación de una biblioteca mutante GFP-etiquetados por mutagénesis de transposones y el desarrollo de cribado de alto contenido de enfoques para la identificación simultánea de múltiples fenotipos transposón-asociado. Nuestro modelo de trabajo es la bacteriano patógeno intracelular Coxiella burnetii, el agente etiológico de la fiebre Q zoonosis, que se asocia con severe brotes con la consiguiente carga sanitaria y económica. La naturaleza intracelular obligado de este patógeno ha, hasta hace poco, obstaculizado gravemente la identificación de los factores bacterianos implicados en las interacciones de patógenos de acogida, por lo que de Coxiella el modelo ideal para la implementación de enfoques de alto rendimiento / alto-contenido.

Tras el aislamiento de mutantes de transposón, sola colonia cebador de PCR es un método robusto y de alto rendimiento para identificar el sitio de inserción del transposón para cada mutante. Este enfoque se deriva de un protocolo típico PCR anidada pero aquí un único cebador hibrida específicamente y / o no específicamente a la plantilla de ADN dependiendo de la rigurosidad de la temperatura de recocido (Figura 1A). Los productos típicos de PCR consisten en múltiples fragmentos de ADN, la mayoría de los cuales son específicos (Figura 1B). El uso de un cebador de secuenciación diferente que hibrida aguas arriba derecha de la ITR transposón, y aguas abajo de la secuencia reconocida por el cebador de amplificación proporciona especificidad para la etapa de secuenciación (Figura 1C). Software automatizado para el análisis de secuencias alinea las secuencias obtenidas en el genoma Coxiella proporcionar el sitio exacto del transposón inserciones (Figura 1C). Todas las inserciones de transposones pueden ser entonces annotated sobre el genoma Coxiella (Figura 1D). Cada mutante Coxiella se aísla y se amplifica axénicamente en ACCM-2 medio antes de su almacenamiento o de detección. La Figura 2 ilustra un ejemplo de 38 mutantes de transposón en 16 puntos / icm genes Coxiella (Figura 2A). Para evaluar la viabilidad de los mutantes de Coxiella, curvas de crecimiento axénicos se obtienen mediante el muestreo de cultivos bacterianos durante 7 días después de la inoculación y aplicando el ensayo de concentración bacteriana se describe en 1.5 (Figurie 2B). Mutantes amplificados se incuban a continuación con las células epiteliales, por triplicado en placas de 96 pocillos durante 7 días. Todos los mutantes generados Coxiella siendo GFP-etiquetados, las curvas de crecimiento intracelular se obtienen mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de GFP de cada pozo, cada 24 horas, y el trazado de los valores medidos como una función del tiempo (Figura 2C). Intrcurvas de crecimiento acelulares proporcionan un análisis cuantitativo de los fenotipos asociados con cada inserción del transposón en el genoma Coxiella. Para agregar información cualitativa sobre los mismos mutantes transposón, se optó por la adquisición de imágenes y análisis automatizado. Siete días después de la infección, las placas son fijos, procesado por inmunofluorescencia como se describe en 4 y se analizaron usando un microscopio de epifluorescencia automatizado como se describe en 5. automatizada de software de análisis de imágenes como CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) procesa los canales adquiridos independientemente y segmentos identificados objetos para el análisis comparativo (Figura 3). Esto permite la identificación y caracterización morfológica de núcleos de células huésped, los contornos de células, lisosomas y Coxiella colonias (Figura 3 paneles superiores). La correlación de colonias Coxiella con las células y permite que los lisosomas identificatiy el análisis morfológico específico de Coxiella vacuolas -Con (que son LAMP1 positivo, Figura 3 panel inferior izquierdo). La correlación de colonias Coxiella con contornos célula huésped permite la identificación y el análisis morfológico específico de las células infectadas (Figura 3 panel central inferior). Por último, los 4 canales se combinan para fines de control de calidad y la ilustración (Figura 3 panel de abajo a la derecha). Los datos obtenidos de análisis de imagen automatizado se pueden trazar uno contra el otro para obtener &quot;gráficos de dispersión multi-fenotípicos&quot;. Como ejemplo, en la Figura 4A, el área media (en m 2) de las colonias de Coxiella se representa gráficamente frente al número de colonias por célula (Figura 4A), con el fin de identificar mutaciones que afectan a la replicación intracelular de Coxiella (fenotipo de replicación) y / o la capacidad de las bacterias para invadir las células huésped (internafenotipo lización). Se utilizó el análisis estadístico para definir las regiones en el gráfico de dispersión resultante correspondiente a (-4 &lt;Z-score ≤ -2) y grave (Z-score ≤ -4) fenotipos leves. Se observaron mutantes en 3 grupos principales: mutaciones que dieron como resultado un crecimiento intracelular defectuosa de Coxiella fueron agrupados en la parte más a la izquierda de la parcela (Figura 4A, rosa y puntos rojos); mutaciones que afectaban internalización Coxiella en las células se agruparon en la parte inferior de la parcela (Figura 4A, azul claro y oscuro puntos) y, finalmente, puntos verdes en el extremo derecho de la región de la trama corresponden a mutaciones que resultan en fenotipos no significativas ( Z-score&gt; -2). Es importante destacar que los mutantes que no logran replicar, pero todavía son capaces de invadir las células huésped, se detectan después de 7 días de la infección como bacterias individuales o pequeñas colonias, junto a la sede de los núcleos celulares (Figura 4C, segundo panel). Por lo tanto, el tamaño de Coxiella &quot;coloempre- &quot;se verá afectado de manera significativa, pero el número de células infectadas no variará en comparación con las células infectadas WT Coxiella. Por el contrario, las mutaciones que afectan a la capacidad de Coxiella para invadir las células huésped resultan en una disminución en el número de colonias / célula. Cuando este número es significativamente inferior a 1, indica que, en promedio, hay una disminución en el número total de células infectadas. Alternativamente, el área media (en m 2) de las colonias de Coxiella puede registrarse en el número de células huésped sobrevivían a la infección (Figura 4B), para identificar mutaciones que confieren citotoxicidad para Coxiella (fenotipo citotóxico). Como el anterior, se utilizó el análisis estadístico para definir las regiones en el gráfico de dispersión resultante correspondiente a (-4 &lt;Z-score ≤ -2) y grave (Z-score ≤ -4) fenotipos leves. La mayoría examinados mutaciones no afectó significativamente la supervivencia celular, independientemente de la replicación bacteriana dentro de anfitrióncélulas (Figura 3B puntos verdes). 37 mutaciones supervivencia de la célula huésped ligeramente afectada (Figura 3B, puntos rojos de luz), y 7 mutaciones fueron particularmente perjudiciales para el anfitrión de la supervivencia celular (Figura 3B, puntos de color rojo oscuro). Tenga en cuenta que los parámetros adicionales obtenidos por el procedimiento de análisis de imágenes automatizado se pueden utilizar para derivar otros apartados, de acuerdo a las necesidades experimentales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Secuenciación y anotación de los mutantes de transposón Coxiella (A) sola colonia cebador de PCR se utiliza para amplificar fragmentos de ADN que contienen el sitio de inserción del transposón. Un cebador de amplificación (Amp) se utiliza tanto como un cebador específico y no específico dependiendo de la rigurosidad de la temperatura de recocido. (B) Resultado Típico de colonia única cebador de PCR. Cada Reactien produce una serie de fragmentos de tamaño variable, algunos de los cuales contienen el sitio de inserción del transposón; algunos otros son amplificadas al azar como subproductos del ciclo de PCR de baja rigurosidad. (C) El uso de un cebador de secuenciación (SEC) que se hibrida con la secuencia de transposón permite la secuenciación de los fragmentos de interés. Software (D) Análisis de secuencias permite la anotación automática de transposón inserciones en el genoma bacteriano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Axénicas y crecimiento intracelular de mutantes transposón Coxiella (A) En la pantalla del piloto, hemos aislado, secuenciado y apantallado 38 mutantes transposón en 16 g núcleoenes del sistema de secreción dot / icm Coxiella (indican en rojo). (B) A fin de evaluar la viabilidad de cada mutante de transposón, el crecimiento de cada aislamiento en medio de cultivo axénicos se monitoriza durante 8 días utilizando un marcado con fluorescencia agente de intercalación de ADN. (C) Cada mutante se utiliza entonces para infectar a las células epiteliales. A medida que el transposón posee un cassette GFP, el crecimiento de bacterias intracelulares se controla más de 7 días de la infección siguiendo las variaciones de la fluorescencia de GFP asociada con la replicación Coxiella, utilizando un lector de microplacas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: automatizado de análisis de imágenes de infecciones Coxiella Un auto.microscopio de epifluorescencia acoplado se utiliza para la imagen 21 posiciones por pocillo por triplicado de placas de 96 pocillos. Los segmentos de software de análisis de imágenes de objetos en cada uno de los canales adquiridos para la cuantificación y el análisis. En todos los casos, se excluyen los objetos que tocan la frontera de las imágenes. (A) El canal de Hoechst se utiliza para identificar los núcleos de la célula huésped (en el círculo en verde). (B) Estos son utilizados como semillas para identificar los contornos de la célula huésped en el canal de Cy3 (la posición de los núcleos es un círculo en azul, los contornos celulares están en verde). (C) El canal de Cy5 se utiliza para identificar compartimentos LÁMPARA1-positivo (un círculo en verde); Sólo los objetos incluidos en los contornos celulares previamente identificados (en rojo) se conservan para el análisis de imágenes. (D) El canal de GFP se utiliza para identificar colonias Coxiella (en el círculo en verde). (E) correlacionar colonias Coxiella con compartimentos LÁMPARA1-positivo permite la identificación de Coxiella </em&gt; vacuolas -Con (CCV); Sólo los objetos incluidos en los contornos celulares previamente identificados (en verde) se conservan para el análisis de imágenes. (F) correlacionar colonias Coxiella con contornos celulares permite la identificación de células infectadas (pseudocoloreada). (G) Imágenes adquiridas en los 4 canales de fluorescencia (que corresponde a las colonias Coxiella (verde), núcleos de las células huésped (azul), membrana plasmática de la célula huésped (gris), compartimentos LÁMPARA1-positivo (rojo)) se fusionan y se utiliza para la ilustración y la calidad control. Escala de Barras 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: la identificación a gran escala de los factores que intervienen en Coxiella huésped / patógeno interactúaniones. (A) La zona media (en m 2) de las colonias de Coxiella se traza contra el número relativo de colonias por células, para identificar de replicación y de internalización fenotipos de interés. Los puntos verdes representan fenotipos que se desvían de WT Coxiella por un Z-score&gt; -2 (no significativo). Rosa y puntos azules claros representan replicación y de internalización fenotipos respectivamente, con una puntuación Z entre -2 y -4 (fenotipos leves). Puntos azules oscuros Roja y representan fenotipos con un Z-score ≤ -4 (fenotipos fuertes). (B) El área media (en m 2) de las colonias de Coxiella se representó frente al número total de células (infectadas y no infectadas) que sobrevivieron 7 días de la infección para estimar el efecto citotóxico resultante de las inserciones de transposones. Los puntos verdes representan fenotipos que se desvían de WT Coxiella por un Z-score&gt; -2 (no significativo). Los puntos rosados ​​representan ph citotóxicaenotypes con una puntuación Z entre -2 y -4 (fenotipos leves). Los puntos rojos representan fenotipos citotóxicos con un Z-score ≤ -4 (fenotipos fuertes). Las flechas indican mutantes ilustrados por la letra minúscula correspondiente en C. (C) Imágenes representativas de la replicación, la internalización y fenotipos citotóxicos. En todos los casos, los núcleos de células huésped están en rojo, Coxiella colonias son de color verde. Escala de Barras 50 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Coxiella burnetii es una bacteria intracelular gramnegativos obligado responsable de la fiebre Q enfermedad zoonótica. Aquí se describen los métodos para la generación de mutantes de transposón fluorescente Coxiella así como la identificación automatizada y el análisis de la internalización, la replicación y citotóxicos fenotipos resultantes.

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