Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Studiet av värd / patogen interaktioner har visat sig vara en märklig metod för att förstå bakterieinfektioner och utveckla alternativa strategier för att motverka infektionssjukdomar. Men på grund av den mångfald av strategier som utarbetats av olika bakteriella patogener, identifiering och karakterisering av bakteriella virulensfaktorer och värd signalvägar som är riktade vid infektioner utgör en verklig utmaning. Detta kräver utveckling av nya metoder för storskalig kartläggning av viktiga värden / patogen interaktion nav. Den senaste tidens utveckling av innovativa, hög genomströmning och hög-innehåll screeningmetoder utgör en ovärderlig resurs som kan anpassas till studiet av intracellulära bakteriella patogener 15. Här har vi använt zoonotiska bakteriell patogen Coxiella burnetii som en modell för att utveckla screening strategier som kombinerar transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser. Importantly denna screeningmetod medger samtidig övervakning av flera steg i Coxiella intracellulära cykeln, vilket ger en helhetsbild av de strategier som utvecklats av denna bakterie att invadera, replikera och kvarstå inom infekterade celler. Den strategi som beskrivs här bygger på två väletablerade tekniker, transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser, som med framgång har tillämpats till studiet av bakteriella patogener. Kombinera dessa tekniker i samband med hög genomströmning / high-innehåll skärmar ger oss möjlighet att utvärdera effekterna av ett stort antal bakteriella mutationer genom att analysera ett mycket stort antal händelser (typiskt 15.000 infekterade celler per bakterie mutationer avbildade och analyseras). Detta ger en viktig statistisk analys av händelser såsom bakteriell invasion av värdceller och intracellulär replikering, som är till sin natur, med förbehåll för hög variabilitet. Det är viktigt att notera att andra än ep cellinjerithelial kan användas för denna typ av screening. Emellertid platta och stora epitelceller är optimala för bildanalys som värdcellorganeller är lättare att upptäcka. Eftersom majoriteten av automatiserade mikroskop kan automatiskt hantera ett stort antal plattor, det finns nästan inga gränser för antalet mutanter som kan screenas samtidigt. Beroende på den patogen, kan användaren förmånen att använda en epifluorescens eller ett konfokalt mikroskop. Tidpunkten för bildtagning kommer främst att bero på känsligheten hos mikroskopkamera, på antalet fält som förvärvats per brunn och på antalet kanaler som köps per synfält. Användaren kan bestämma hur man justera dessa faktorer för att optimera screening protokollet. Som ett exempel, avbildas vi en 96-brunnsplatta / h med användning av de betingelser som anges i punkt 5.1. Bildanalys beror till stor del på maskinen (eller kluster av maskiner) används. Vi använder en 12-core (2 x 3,06 GHz 6 kärnor), 48 GB RAM arbetsstation. Denna maskin kräver approxifär 40 minuter för att analysera bilder som förvärvats från en platta. En viktig aspekt som skall tas med i beräkningen vid utveckling av dessa analyser är inrättandet av nya (eller optimering av befintliga) protokoll för att tillåta manipulation och bearbetning av ett stort antal prover. Ett typiskt exempel är utvecklingen av den inre primer koloni-PCR metod, som tillät oss att snabbt förstärka och sekvens Coxiella DNA-fragment innehållande platsen för insättning av varje transposon, från mycket små prover. Baserat på vår erfarenhet, har hifi-polymeras noga utvalda och testade för att få reproducerbara resultat. Den enda begränsningen av denna metod kan gömma sig i observationen att, i de flesta fall, ca 30% av de behandlade proverna inte utnyttjas, antingen på grund av PCR eller sekvense steg. Men med tanke på att isoleringen av nya transposonmutanter mutanter Coxiella inte är ett hastighetsbegränsande steg, detta inte represkickade en viktig fråga. På samma sätt har utvecklingen av en tillförlitlig analys för att kvantifiera bakteriell koncentration av muterade bestånd varit avgörande för denna strategi. På grund av tendensen hos Coxiella att aggregera när i suspension, är användningen av optiska densitetsavläsningarna inte är tillämpliga för att beräkna koncentrationen av Coxiella kulturer och den enda existerande alternativet var kvantitativ PCR (qPCR). Här är användningen av ett fluorescensmärkta DNA-inskjutande medlet signifikant påskyndas bakterier kvantifiering. Detta tillvägagångssätt kan också dra nytta av användningen av stabila cellinjer som uttrycker fluorescerande markörer för flera intracellulära avdelningar beroende på patogenen används. En annan viktig aspekt är användningen av cellodlingsmedier som saknar fenolrött. Vi observerade att denna pH-indikator har en naturlig fluorescens spänner de röda och gröna spektrum som mättar signal som är inspelad på den automatiserade fluorescensläsare. THan strategi som presenteras här bygger på slumpmässigt transposonmutagenes. För mutanter av intresse, rekommenderar vi att validera unika införlivande (och clonality) med hjälp av Southern blot och PCR-amplifieringar av transposonen insättningsstället. Förutom den utrustning som beskrivs i protokollet avsnittet lag intresserade av att använda metoden screening presenteras här kommer att ta stor fördel i inrättandet av en relationsdatabas för datainsamling, en server för lagring av data och en arbetsstation för snabb bildanalys. Viktigt är att metoden beskrivs här är lämpad för studier av andra intracellulära bakteriella patogener som en slumpmässig mutagenes metod existerar för patogenen kan cellinjer infekteras av patogenen och detta visar en specifik fenotyp under infektion.

Den framväxande, endemisk bakterien Coxiella burnetii är ansvarig för stora utbrott av Q-feber, en försvagande influensaliknande zoonos med allvarliga hälso- och ekonomiska konsekvenser 1. De viktigaste reservoarerna Coxiella är husdjur och lantbruksdjur, och man räknar med att mer än 90% av mjölkkor i USA bär C. burnetii 2. Människor är oavsiktliga värdar som är infekterade av inandning av förorenade aerosoler. Human Q-feber manifesterar antingen som en akut eller kronisk sjukdom, som kan få ödesdigra komplikationer med en dödlighet når 65% 1,3. Med en infektiös dos av 1 till 10 organismer, är Coxiella den mest infektiösa patogenen känd och det har undersökts som ett potentiellt biologiskt vapen 4. Den senaste tidens explosiva utbrott av Q-feber i Nederländerna (2007 - 2010), med fall eskalerande från 182 till mer än 2.000 per år, står som ett exempel på den allvarliga virulens hos denna patogen5. Den anmärkningsvärda effektivitet Coxiella infektioner sannolikt i samband med dess motståndskraft mot miljöstress i kombination med dess unika anpassning till värdceller. Faktum är Coxiella närvarande i miljön i form av metaboliskt inaktiva små cellvarianter (SCV), som är anmärkningsvärt resistenta mot flera svåra förhållanden (uttorkning, temperatur, etc.). SCVs är upp tagen av fagocytiska celler via α V β 3 integriner 6 medan invasion av icke-fagocytiska celler medieras av Coxiella vidhäftning / invasion OmpA 7 och en ännu oidentifierad receptor. Efter upptag, Coxiella bosatt i åtsittande vakuoler, positiva för de tidiga endosomala markörer Rab5 och EEA1 8. Bakterier svarar på endosomal försurning genom att konvertera till metaboliskt aktiva stora cell varianter (lätta nyttofordon) och aktivera en Dot / Icm typ 4 sekretionssystemet (T4SS) 9, Mycket homolog med den av Legionella pneumophila 10. Utsöndringen av Dot / Icm effektorer tillåter Coxiella att generera ett stort, LAMP1 positiva sura fack som innehåller aktiva lysosomala enzymer där bakterier kan frodas och aktivt skydda infekterade celler från apoptos 11. Därför är den intracellulära cykel av Coxiella kontrolleras av Dot / ICM-medierad translokation av bakteriella effektorer 12, dock mikrobiella faktorer i värdcellinvasion, bakteriell replikering och spridning av infektionen fortfarande till stor del okända. Kombinera transposonmutagenes och fluorescensbaserade analyser, utvecklar vi objektiva metoder för samtidig identifiering av bakteriella faktorer inblandade i de viktigaste stegen av Coxiella infektioner: 1) internalisering inom värdceller, 2) intracellulär replikering, 3) cell till cell sprids och 4) uthållighet. Till dags dato har vi screenas över 1.000 mutations i 500 Coxiella kodande sekvenser, som försett oss med oöverträffade insikter värd-patogen interaktioner som reglerar Coxiella patogenes 7. Notera kan tillämpat denna metod för studier av andra intracellulära patogener som delar cellbiologi funktioner med Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion och kolonisering av värdceller från bakteriella patogener beror på aktiviteten hos ett stort antal prokaryota proteiner, definierat som virulensfaktorer, som kan undergräva och manipulera viktiga värdfunktioner. Studiet av värd / patogen interaktioner är därför oerhört viktigt att förstå bakterieinfektioner och utveckla alternativa strategier för att motverka infektionssjukdomar. Detta tillvägagångssätt kräver emellertid utvecklingen av nya hög genomströmning analyser för objektiv, automatiserad identifiering och karakterisering av bakterie virulensdeterminanter. Här beskriver vi en metod för generering av en GFP-märkt mutantbibliotek genom transposon mutagenes och utveckling av hög halt screening metoder för samtidig identifiering av multipla transposoninfogningar associerade fenotyper. Vår arbetsmodell är den intracellulära bakteriell patogen Coxiella burnetii, det etiologiska medlet för zoonos Q-feber, som är associerad med sigVere utbrott med åtföljande hälsa och ekonomisk börda. Den obligat intracellulära naturen hos denna patogen har, tills nyligen, allvarligt försvåras identifieringen av bakteriella faktorer som värd patogen interaktioner, vilket av Coxiella den idealmodell för genomförandet av hög genomströmning / hög innehålls metoder.

Vid isolering av transposonmutanter mutanter, är enda primer koloni-PCR en robust, hög genomströmning metod för att identifiera platsen för transposoninfogning för varje mutant. Detta tillvägagångssätt härrör från en typisk innesluten PCR-protokollet men här en enkel primer hybridiserar specifikt och / eller icke-specifikt till mall-DNA beroende på stringensen av glödgningstemperatur (Figur 1A). De typiska PCR-produkterna består av flera DNA-fragment, varav de flesta är specifika (Figur 1B). Användningen av en annan sekvenseringsprimer som hybridiserar just uppströms om transposonen ITR, och nedströms om den sekvens som känns igen av amplifieringsprimern ger specificitet för sekvensesteget (Figur 1C). Automatiserad mjukvara för sekvensanalys anpassar de erhållna sekvenserna till Coxiella genomet ger den exakta platsen för transposoninsättningar (Figur 1C). Alla transposoninsättningar kan vara sedan annotated på Coxiella genomet (figur 1D). Varje Coxiella mutanten isoleras och amplifieras axeniskt i ACCM-2 medium före antingen lagring eller sållning. Figur 2 illustrerar ett exempel på 38 transposonmutanter mutanter i 16 punkter / icm Coxiella gener (Figur 2A). För att bedöma lönsamheten för Coxiella mutanter är axenisk tillväxtkurvor som erhållits genom provtagning bakteriekulturer i 7 dagar efter ympning och tillämpa analysen bakteriekoncentrationen som beskrivs i 1.5 (Figurie 2B). Amplifierade mutanter inkuberas sedan med epitelceller, i tredubbla 96-brunnsplattor för 7 dagar. Alla Coxiella mutanter genererade varvid GFP-märkta, är intracellulära tillväxtkurvor som erhållits genom mätning av GFP-fluorescensintensiteten hos varje brunn, varje 24 h, och plottning av de uppmätta värdena som en funktion av tiden (figur 2C). Intracellulära tillväxtkurvor ger kvantitativ analys av de fenotyper som är förknippade med varje transposoninfogning i Coxiella genomet. Om du vill lägga kvalitativ information om samma mutanter transposonmutanter, valde vi för automatiserad insamling och analys. Sju dagar efter infektion, plattor är fasta, behandlas för immunofluorescens som beskrivs i 4 och analyseras med hjälp av en automatiserad, epifluorescensmikroskop som beskrivs i 5. Automatiserad bildanalys program som CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) behandlar de förvärvade kanaler självständigt och segment identifieras föremål för jämförande analys (Figur 3). Detta gör det möjligt att identifiera och morfologiska karakterisering av värdcellkärnor, cell konturer, lysosomer och Coxiella kolonier (Figur 3 toppanelerna). Korrelering Coxiella kolonier med celler och lysosomer tillåter identifiering tapå och specifik morfologisk analys av Coxiella-innehållande vakuoler (som är LAMP1 positivt, Figur 3 nedre vänstra panelen). Korrelering Coxiella kolonier med värdcell konturer möjliggör identifiering och specifik morfologisk analys av infekterade celler (Figur 3 längst ner i mitten panel). Slutligen är de fyra kanalerna fusione som illustration och kvalitetskontrolländamål (fig 3 nedre högra panelen). Data som erhållits från automatiserad bildanalys kan plottas mot varandra för att få &quot;multi-fenotypiska scatter tomter&quot;. Som ett exempel, i figur 4A den genomsnittliga arean (i ^ m 2) av Coxiella kolonier är avsatt mot antalet kolonier per cell (fig 4A), för att identifiera mutationer som påverkar intracellulär replikation av Coxiella (replikationsfenotyp) och / eller kapaciteten hos bakterier att invadera värdceller (internatiosering fenotyp). Statistisk analys användes för att definiera regionerna i den resulterande punktdiagram motsvarande milda (-4 &lt;Z-score ≤ -2) och svår (Z-score ≤ -4) fenotyper. Mutanter observerades i 3 huvudområden: mutationer som resulterade i en defekt intracellulär tillväxt Coxiella grupperades i vänstra delen av tomten (Figur 4A, rosa och röda prickar); mutationer som påverkade Coxiella interna i celler grupperades i den nedre delen av tomten (Figur 4A, ljust och mörkt blå prickar) och slutligen, gröna prickar i längst till höger regionen av tomten motsvarar mutationer som resulterar i icke-signifikanta fenotyper ( Z-score&gt; -2). Viktigt är mutanter som inte replikera men som fortfarande är i stånd att invadera värdceller, detekteras efter 7 dagar av infektion som enkla bakterier, eller små kolonier, som gränsar till värdcellkärnor (fig 4C, andra panel). Således, storleken av Coxiella &quot;cologen &quot;kommer att påverkas i hög grad, men antalet infekterade celler kommer inte att variera jämfört med WT Coxiella infekterade celler. Tvärtom, mutationer som påverkar förmågan av Coxiella att invadera värdceller resulterar i en minskning av antalet kolonier / cell. När detta antal är betydligt under 1, betyder det att, i genomsnitt, det finns en minskning av det totala antalet infekterade celler. Alternativt kan den genomsnittliga område (i pm 2) av Coxiella kolonier ritas mot antalet värdceller som överlever infektion (Figur 4B), för att identifiera mutationer som ger cytotoxicitet till Coxiella (cytotoxiska fenotyp). Som ovan, var statistisk analys som används för att definiera regionerna i den resulterande punktdiagram motsvarande milda (-4 &lt;Z-score ≤ -2) och svår (Z-score ≤ -4) fenotyper. Mest skärmad mutationer påverkade inte signifikant cellöverlevnad, oavsett bakteriell replikering inom värdceller (Figur 3B gröna prickar). 37 mutationer milt påverkade värdcellöverlevnad (Figur 3B, ljusröd punkter), och 7 mutationer var särskilt skadligt för värdcellöverlevnad (Figur 3B, mörka röda prickar). Observera att ytterligare parametrar som erhållits genom den automatiserade bildanalysförfarande kan användas för att härleda andra diagram, enligt experimentella behov. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figur 1:. Sekvensering och annotering av Coxiella transposonmutanter mutanter (A) Single primer koloni-PCR används för att förstärka DNA-fragment som innehåller platsen för transposoninfogning. En amplifieringsprimer (Amp) används både som en specifik och icke-specifik primer beroende på stringensen av glödgningstemperaturen. (B) Typiska resultat av enkel primer koloni-PCR. Varje Reactipå producerar ett antal fragment av varierande storlek, varav en del innehåller transposonen insättningsstället; några andra är slumpvis amplifierade som biprodukter av låg stringens PCR-cykeln. (C) Användningen av en sekvenseringsprimer (Seq) som hybridiserar till transposon sekvensen tillåter sekvensering av fragment av intresse. (D) mjukvara för sekvensanalys möjliggör automatisk annotering av transposoninsättningar på det bakteriella genomet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figur 2:. Axenisk och intracellulär tillväxt Coxiella transposonmutanter mutanter (A) I pilot skärmen, har vi isolerat, sekvenserades och screenades 38 transposonmutanter mutanter i 16 kärn genes av Coxiella prick / ICM sekretionssystemet (markerade med rött). (B) För att bedöma lönsamheten för varje transposon mutant, tillväxten av varje isolat i axenisk odlingsmedium övervakas under 8 dagar med en fluorescerande taggade DNA interkalerande medel. (C) Varje mutant används därefter för att infektera epitelceller. Som transposon har en GFP kassett, är intracellulär bakterietillväxt övervakades under 7 dagar av infektion genom att följa variationer av GFP fluorescens i samband med Coxiella replikering, med hjälp av en mikroplattläsare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figur 3: Automatiserad bildanalys av Coxiella infektioner En automatisk.Mated epifluorescensmikroskop används för att bilden 21 positioner per brunn av tredubbla 96-brunnsplattor. Bildanalysmjukvarusegment objekt i varje förvärvade kanaler för kvantifiering och analys. I samtliga fall är föremål vidrör gränsen av bilderna uteslutas. (A) Hoechst-kanalen används för att identifiera värdcellkärnor (inringade i grönt). (B) Dessa används som frön för att identifiera värdcell konturer i Cy3 kanalen (positionen för kärnor är inringat i blått, cell konturer är i grönt). (C) Den Cy5-kanalen används för att identifiera LAMP1 positiva fack (inringade i grönt); bara de objekt som ingår i de tidigare identifierade cell konturer (i rött) behålls för bildanalys. (D) GFP-kanalen används för att identifiera Coxiella kolonier (inringade i grönt). (E) Korrelering Coxiella kolonier med LAMP1 positiva fack möjliggör identifiering av Coxiella </em&gt; -innehållande vakuoler (CCVS); bara de objekt som ingår i de tidigare identifierade cell konturer (i grönt) behålls för bildanalys. (F) Korrelering Coxiella kolonier med cell konturer möjliggör identifiering av infekterade celler (pseudocolored). (G) Bilder som förvärvats i 4 fluorescenskanalerna (motsvarande Coxiella kolonier (grön), värdcellkärnor (blå), värdcell plasmamembranet (grå), LAMP1-positiva fack (röd)) slås ihop och används för att illustrera och kvalitet kontroll. Skala barer 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figur 4: Storskalig identifiering av Coxiella faktorer som värd / patogen samverkarjoner. (A) Den genomsnittliga område (i pm 2) av Coxiella kolonier plottas mot det relativa antalet kolonier per cell, för att identifiera replikering och internalise fenotyper av intresse. Gröna prickar representerar fenotyper som avviker från WT Coxiella av en Z-score&gt; -2 (ej signifikant). Rosa och ljusblå prickar representerar replikering och internalise fenotyper respektive med en Z-poäng mellan -2 och -4 (milda fenotyper). Röd och mörkblå prickar representerar fenotyper med Z-score ≤ -4 (starka fenotyper). (B) Den genomsnittliga område (i pm 2) av Coxiella kolonier avsattes mot det totala antalet celler (infekterade och inte infekterade) som överlevde 7 dagar på infektion för att uppskatta den cytotoxiska effekten till följd av transposoninsättningar. Gröna prickar representerar fenotyper som avviker från WT Coxiella av en Z-score&gt; -2 (ej signifikant). Rosa prickar representerar cytotoxiska phenotypes med Z-poäng mellan -2 och -4 (milda fenotyper). Röda prickar representerar cytotoxiska fenotyper med Z-score ≤ -4 (starka fenotyper). Pilar indikerar mutanter illustreras av motsvarande gemena bokstaven i C. (C) Representativa bilder av replikering, internalisering och cytotoxiska fenotyper. I samtliga fall, värdcellkärnor är i rött, Coxiella kolonier är i grönt. Skala barer 50 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii är en obligat intracellulär gramnegativ bakterie som är ansvarig för den zoonos Q-feber. Här beskriver vi metoder för generering av Coxiella fluorescerande transposonmutanter mutanter samt automatisk identifiering och analys av de resulterande interna, replikering och cytotoxiska fenotyper.

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En genetisk skärm för att isolera Toxoplasma gondii Host-cell avstigning mutanter

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Underlätta Drug Discovery: En automatiserad hög halt Inflammation analys i zebrafisk

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analys för kvantifiering av intracellulär mykobakteri anpassad för screening med högt genomströmning/högt innehåll

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identifiering av nya gener associerade med alginat Produktion i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Med hjälp av Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon mutagenes

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Tillämpa Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) för att undersöka Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Ljuddämpning

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Hög genomströmning parallella sekvensering att mäta konditionen av Leptospira interrogans Transposon införande mutanter under gyllene syriska Hamster infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av beställt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon införande mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visuella och mikroskopiska utvärdering av Streptomyces utvecklingsmässiga mutanter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...