Name: generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ev sahibi / patojen etkileşimlerinin araştırılması bakteriyel enfeksiyonların anlamak ve bulaşıcı hastalıkların karşı alternatif stratejiler geliştirmek için dikkate değer bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, farklı bakteriyel patojenler tarafından hazırlanan stratejilerin çeşitliliği, bakteriyel virülans faktörleri ve enfeksiyonlar sırasında hedeflenen sinyal yollarının host kimlik ve karakterizasyonu gerçek bir meydan okuma temsil etmektedir. Bu anahtar konak / patojen etkileşimi göbeklerinin büyük ölçekli tanımlama için yeni yaklaşımların geliştirilmesi için çağrıda bulunmaktadır. yenilikçi, yüksek verimlilik ve yüksek içerik tarama tekniklerinin son gelişme hücre içi bakteriyel patojenler 15 çalışmaya adapte edilebilir paha biçilmez bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, transpozon mutagenezi ve floresan bazlı tahliller kombine bir tarama yaklaşımların geliştirilmesi için bir model olarak zoonotik bakteriyel patojen Coxiella burnetii&#39;ye kullandık. Importantly, bu tarama yöntemi, işgal çoğaltmak ve enfekte hücreler içinde devam için bu bakterinin tarafından geliştirilen stratejilerin küresel bakış sağlayan, Coxiella içi döngüsünün birden adımların eşzamanlı olarak izlenmesine olanak verir. Burada tarif edilen yaklaşım, bakteriyel patojenlerin çalışma uygulanmış iki iyi bilinen tekniklerle, transpozon mutagenezi ve floresan bazlı deneylerde, dayanmaktadır. Yüksek verimli / yüksek içerik ekranlarında bağlamında bu tekniklerin birleştiren bize olayların çok yüksek sayıda (bakteriyel mutasyon başına tipik 15.000 enfekte olan hücreleri görüntülü ve analiz edilir) analiz ederek bakteriyel mutasyon sayısının yüksek etkilerini değerlendirmek için izin verir. Bu tür, doğası gereği, yüksek değişkenliğe tabidir konak hücreleri ve hücre içi çoğaltma, bakteriyel işgali gibi olaylar önemli bir istatistiksel analiz sağlar. Bu ep dışındaki bu hücre hatları dikkat etmek önemlidirithelial tarama bu tür için kullanılabilir. Konakçı hücre organelleri tespit etmek daha kolay Ancak, düz ve büyük epitel hücreleri görüntü analizi için uygun olan. Otomatik mikroskoplar çoğunluğu otomatik plakaların sayıda işleyebilir, çünkü aynı anda elenebilir mutantların sayısı neredeyse hiçbir sınırı vardır. Patojenin bağlı olarak, kullanıcı teneke ayrıcalık, bir Epifloresans veya konfokal mikroskop kullanımı. görüntü elde etme zamanı çoğunlukla kuyu başına ve görüş alanı başına elde edilen kanalların sayısı edinilen alanların sayısı, mikroskop kameranın duyarlılığına bağlıdır. Kullanıcı tarama protokolü optimize etmek için bu faktörleri nasıl ayarlanacağı karar verebilirsiniz. Bir örnek olarak, bu noktada 5.1 de belirtilen koşullar kullanılarak, bir 96-çukurlu plaka / saat görüntülenmiş. Görüntü analizi büyük ölçüde kullanılan makine (veya makinelerin küme) bağlıdır. Biz 12 çekirdekli (2 x 3.06 GHz 6 Çekirdekli), 48 GB RAM iş istasyonu kullanın. Bu makine approxi gerektiriryaklaşık 40 dakika bir plaka elde edilen görüntüleri analiz etmek. Bu analizleri uygularken, gelişmekte olan yeni resim kadar (veya mevcut optimizasyonu) numune çok sayıda manipülasyon ve işlenmesini sağlamak için protokolleri olduğunda önemli bir yönü dikkate alınacak. Tipik bir örnek bize hızla yükseltmek ve izin tek primer koloni PCR yaklaşımı, gelişimi çok küçük örneklerden, her transpozonun ekleme siteyi içeren dizisi Coxiella DNA fragmanları. Bizim deneyime dayalı, yüksek kalitede polimeraz özenle seçilmiş ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için test edilmelidir. Bu yaklaşımın tek sınırlama, vakaların çoğunda, işlenmiş örneklerin yaklaşık% 30&#39;u yararlanılamaz değil, gözlem PCR veya sıralama adımlar nedeniyle ya gizleyebilirsiniz. Bununla birlikte, yeni Coxiella transpozon mutantların izolasyonu, bir oran-sınırlayıcı aşama olmadığını dikkate alınarak, bu repre etmezönemli bir sorun gönderdi. Benzer şekilde, mutant stokların bakteri konsantrasyonunu ölçmek için güvenilir bir tahlil gelişimi bu yaklaşım için anahtar olmuştur. Süspansiyon içinde toplamak için Coxiella eğilimi nedeniyle, optik yoğunluk okumaları kullanılmasıydı Coxiella kültürler ve sadece mevcut alternatif konsantrasyonunu kantitatif PCR (qPCR) hesaplamak için geçerli değildir. Burada, bir floresan etiketli DNA interkalasyon maddesinin kullanımının önemli ölçüde bakteri kantitatif hızlandırdı. Bu yaklaşım, aynı zamanda kullanılan patojene bağlı olarak birkaç hücre içi fluoresan işaretleri ekspres eden stabil hücre çizgilerinin kullanımının avantajını sunar. Bir başka önemli yönü, fenol kırmızısı içermeyen hücre kültür ortamının kullanılmasıdır. Biz bu pH indikatör otomatik floresan okuyucu kaydedilen sinyali doyurur kırmızı ve yeşil spektrum kapsayan doğal bir floresan sahip olduğu görülmektedir. TBurada sunulan strateji rastgele transpozon mutajenezi dayanır. Ilgi mutantlar için, Güney leke ve transpozon ekleme sitenin PCR amplifikasyonlar kullanarak benzersiz transpozisyonlar doğrulama (ve klonalite) tavsiye ederim. Protokol bölümünde açıklanan ekipman yanı sıra, burada sunulan tarama yaklaşımı kullanılarak ilgilenen ekipler, veri toplama, veri depolama için bir sunucu ve hızlı görüntü analizi için bir iş istasyonu için bir ilişkisel veritabanı set up büyük bir avantaj alacak. Önemli bir şekilde, burada, diğer hücre içi bakteriyel patojenlerin çalışma için uygundur tarif edilen yöntem, bir rastgele mutagenez yöntemi patojenin mevcut mesafede, hücre çizgileri patojen ile enfekte olabilir ve bu bir enfeksiyon sırasında, belirli bir fenotip göstermektedir.

gelişmekte olan, endemik bakteri Coxiella burnetii Q ateş, şiddetli sağlık ve ekonomik etkisi 1 ile zayıflatıcı grip benzeri zoonoz büyük salgınlar sorumludur. Coxiella ana rezervuar iç ve çiftlik hayvanları, ve ABD&#39;de süt sığırı% 90&#39;dan fazla C taşıdıkları tahmin ediliyor 2 burnetii. İnsanlar kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla bulaşmış yanlışlıkla ana vardır. İnsan Q humması tezahür ya% 65 1,3 ulaşan mortalite oranı ile ölümcül komplikasyonların olabileceğini akut veya kronik hastalığı gibi. 1 bir enfeksiyon dozu ile - 10 organizmalar, Coxiella bilinen en bulaşıcı patojen ve potansiyel bir biyo silah 4 olarak araştırılmıştır. Hollanda (2007 - 2010) Q ateşi son patlayıcı salgını vakası yılda fazla 2,000 182 tırmanan ile, bu patojenin ciddi virulans bir örnek olarak duruyor5. Coxiella enfeksiyonlarının dikkate değer bir verimi büyük olasılıkla konakçı hücreler için eşsiz uyum ile birlikte çevresel strese karşı direnci ile ilişkilidir. Gerçekten de, Coxiella çok sert koşullar (kuruma, sıcaklık, vs.) önemli ölçüde dirençli olan metabolik olarak aktif olmayan küçük hücreli varyantları (SCV) şeklinde bir ortamda bulunmaktadır. Fagositik olmayan hücreleri istila Coxiella yapışması / istila OmpA 7 ve henüz tanımlanmamış reseptörün aracılık ederken SCVs kadar 3 integrinler 6 β α V ile fagositik hücreler tarafından alınır. Alımı takiben, Coxiella Rab5 ve EEA1 8 erken endozomal belirteçleri için pozitif dar vakuollerin, yaşıyor. Bakteriler Dot / Icm tip 4 salgı sistemini (T4SS) 9 metabolik olarak aktif büyük hücreli çeşitleri (LCVs) dönüştürme ve aktive ederek endozomal asitlenme cevapLegionella pneumophila 10&#39;dakine yüksek ölçüde homolog. Nokta / ICM efektör salgılanması Coxiella bakteri gelişirler ve aktif apoptozis 11 enfekte hücreleri korumak aktif lızozomal enzimleri ihtiva eden büyük bir LAMP1 pozitif asidik bir bölme oluşturmak için izin verir. Bu nedenle, Coxiella hücre içi döngüsü bakteriyel efektörlerinin 12 Nokta / Icm-aracılı translokasyonu ile kontrol edilir, ancak konakçı hücre istilası, bakteriyel replikasyonu ve enfeksiyonunun yayılması yer mikrobiyal faktörler büyük ölçüde bilinmemektedir. Ev sahibi hücre içinde 1) içselleştirme, 2) hücre içi çoğaltma, 3) hücreden hucreye yayılma: transposon mutagenez ve floresans-esaslı tahliller birleştirerek, Coxiella enfeksiyonlarının ana adımları yer bakteriyel faktörlerinin eş zamanlı olarak tanımlanması için tarafsız yaklaşımlar geliştirmektedir ve 4) sebat. Bugüne kadar, 1000 m üzerinde ekranlıCoxiella patogenezi 7 düzenleyen konak-patojen etkileşimleri içine görülmemiş anlayışlar bize sağlanan 500 Coxiella kodlama dizilerinde utations. Dikkat çekici bir şekilde, bu yaklaşım Coxiella hücre biyolojisi özellikleri paylaşan diğer hücre içi patojen çalışmaya uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion ve bakteriyel patojenlerin konakçı hücrelerin kolonizasyonunun bozmak ve temel bir konak işlevlerini manipüle virülans faktörü olarak tanımlanan prokaryotik proteinleri, çok sayıda, aktivitesine bağlıdır. Ev sahibi / patojen etkileşimlerinin araştırılması bakteriyel enfeksiyonların anlamak ve bulaşıcı hastalıkların karşı alternatif stratejiler geliştirmek için bu nedenle son derece önemlidir. Bu yaklaşım, ancak bakteriyel virülans belirleyicileri tarafsız, otomatik tanımlama ve karakterizasyonu için yeni yüksek verimli tahlillerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, transpozon mutagenezi ile GFP etiketli mutant kütüphanesi oluşturulması için bir yöntem tarif ve yüksek içerik tarama gelişimi çok sayıda transpozon ilişkili fenotip eşzamanlı belirlenmesi için yaklaşımlar. Bizim çalışma modeli se ile ilişkili hücre içi bakteri patojen Coxiella burnetii, zoonoz Q ateşi etiyolojik ajandırvere bir sonucu sağlık ve ekonomik yük ile salgınlar. Bu patojenin zorunlu hücre içi doğası, son zamanlara kadar, ciddi Coxiella yüksek verimlilik / yüksek içeriği yaklaşımların uygulanması için ideal bir model haline ana patojen etkileşimlerinde karıştığına bakteriyel faktörlerin tanımlanmasını engellemiştir.

Transposon mutantların izolasyonu üzerine, tek primer koloni PCR her mutant için transpozon yerleştirme siteyi belirlemek için sağlam, yüksek verim yöntemidir. Bu yaklaşım, tipik bir iç içe PCR protokolü türeyen, ancak burada tek bir primer tavlama sıcaklığı (Şekil 1A) sıkılığına bağlı olarak, şablon DNA spesifik ve / veya non-spesifik olarak melezleşir. Tipik bir PCR ürünleri özgü çoğu birden fazla DNA fragmanları (Şekil 1B) oluşur. Sağ transpozon ITR yukan ve büyütme primeri tarafından tanınan sekansının alt baş tavlanan farklı dizileme primeri kullanımı dizileme aşama (Şekil 1C) BY için spesifisite sağlamaktadır. Dizi analizi için otomatik bir yazılım transpozon eklemeler (Şekil 1C) tam yeri sağlayan bir Coxiella genomuna edilen sekansları hizalanır. Tüm transposon eklemeleri sonra ann olabilirCoxiella genomu (Şekil 1D) üzerine otated. Her Coxiella mutantı izole edilmiş ve depolama ya da ayıklama öncesinde ACCM-2 ortamı içinde aksenik biçimde yükseltilir. 2 16 nokta / ICM Coxiella genleri (Şekil 2A), 38 transpozon mutantlarının bir örneğini göstermektedir, Şekil. Coxiella mutantlarının uygulanabilirliğini değerlendirmek için, aksenik büyüme eğrileri 1.5 (Figurie 2B) &#39;de tarif edilen bakteri konsantrasyonu tahlili Aşılama sonrası 7 gün bakteri kültürleri numune alma ve uygulanması ile elde edilir. Amplifiye mutantlar daha sonra, 7 gün için üçlü 96-yuvalı plakalar içinde, epitel hücreleri ile inkübe edilir. Üretilen tüm Coxiella mutantlar GFP etiketli hücre içi büyüme eğrileri de, her 24 saatte, her GFP floresans yoğunluğunu ölçülmesi ve zamanın bir fonksiyonu (Şekil 2C) olarak ölçülen değerlerin konulması sureti ile elde edilir edilir. Intracellular büyüme eğrileri Coxiella genomunda her transpozon ekleme ile ilişkili fenotipleri kantitatif analiz sağlar. Aynı transposon mutantlar hakkında nitel bilgiler eklemek için, otomatik görüntü toplama ve analiz için seçti. Yedi gün plakalar 4 açıklanmıştır ve bu CellProfiler (geniş Enstitüsü, 5. Otomatik görüntü analizi yazılımı tarif edildiği gibi otomatik bir, Epifloresans mikroskop kullanılarak analiz edildiği immünofloresans için işleme, sabittir, enfeksiyondan <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> alınan kanal işlem) bağımsız ve segmentler karşılaştırmalı analizi (Şekil 3) için nesneleri tespit. Bu konak hücre çekirdekleri, hücre konturları, lizozomlar ve Coxiella koloniler (Şekil 3 üst paneller) tanımlanması ve morfolojik karakterizasyonu sağlar. Hücreler ve lizozomlar ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi identificati sağlarve (pozitif LAMP1, Şekil 3 sol alt panel vardır) Coxiella ihtiva-eden vakuollerin özgü morfolojik analizi. Konak hücre konturları ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi kimlik ve enfekte olmuş hücrelerin spesifik morfolojik analizi (Şekil 3 orta alt panel) izin verir. Son olarak, 4 kanal illüstrasyon ve kalite kontrol amaçlı (Şekil 3 sağ alt panel) için birleştirilir. Otomatik görüntü analizinden elde edilen veriler &quot;çok fenotipik dağılım araziler&quot; elde etmek için birbirlerine karşı çizilebilir. Bir örnek olarak, Coxiella kolonilerinin Şekil 4A (um 2) ortalama alan olarak Coxiella (çoğaltma fenotip) ve / veya hücre içi çoğaltma etkileyen mutasyonları tespit etmek için, hücre (Şekil 4A), ortalama koloni sayısı karşı çizilir Ev sahibi hücreleri istila bakterilerin kapasitesi (internakatmanlara ayrılmasına fenotip). İstatistiksel analiz hafif (-4 &lt;Z-skoru ≤ -2) ve şiddetli (Z-skoru ≤ -4) fenotipleri karşılık ortaya çıkan dağılım arsa bölgeleri tanımlamak için kullanıldı. Mutantlar 3 ana kümelerde gözlendi: Coxiella bir kusurlu hücre içi büyüme sonuçlandı mutasyonlar arsa (Şekil 4A, pembe ve kırmızı noktalar) en sol kısmında gruplandırıldı; hücrelerde Coxiella içselleştirilmesi etkilenen mutasyonlar arsa alt kısmında gruplandırıldı (Şekil 4A, açık ve koyu mavi nokta) ve son olarak, arsa sağ çoğu bölgede yeşil noktalar (anlamlı olmayan fenotipleri sonuçlanan mutasyonlar karşılık Z-skoru&gt; -2). Önemli olarak, çoğaltma için başarısız ama yine de konakçı hücreleri istila mümkün olan mutantlar, hücre çekirdekleri (Şekil 4C, ikinci panel) barındırmak için bitişik tek bakteri ya da küçük koloniler, enfeksiyon 7 gün sonra tespit edilir. Bu nedenle, Coxiella boyutu &quot;ColoNies &quot;önemli ölçüde etkilenecek, ama enfekte olmuş hücrelerin sayısı WT Coxiella ile enfekte olan hücreler ile karşılaştırıldığında farklı olmayacaktır. Aksine, konak hücreleri işgal etmek Coxiella kapasitesini etkileyen mutasyonlar koloni / hücre sayısında bir azalmaya neden olur. Bu sayısı önemli ölçüde 1 &#39;in altında olduğu zaman, bu ortalama, enfekte olmuş hücrelerin toplam sayısında bir azalma olduğunu işaret etmektedir. Seçenek olarak ise, Coxiella kolonileri (um 2) ortalama alan Coxiella (sitotoksik fenotip) sitotoksiteye kazandıran mutasyonlar tespit etmek enfeksiyonu (Şekil 4B) hayatta konakçı hücreler, sayısına karşı çizilmiştir edilebilir. Yukarıdaki gibi, istatistiksel analiz hafif (-4 &lt;Z-skoru ≤ -2) ve şiddetli (Z-skoru ≤ -4) fenotipleri karşılık ortaya çıkan dağılım arsa bölgeleri tanımlamak için kullanıldı. En mutasyonlar önemli ölçüde konak içinde bakteriyel çoğalma olursa olsun, hücre yaşamını etkilemedi ekranlıhücreleri (Şekil 3B yeşil noktalar). 37 mutasyon hafif etkilenen konak hücre sağkalım (Şekil 3B, açık kırmızı noktalar) ve 7 mutasyonlar hücre sağkalım (Şekil 3B, koyu kırmızı noktalar) barındırmak için özellikle zararlı idi. Deneysel ihtiyaçlarına göre, otomatik bir görüntü analizi prosedürü ile elde edilen ek parametreler, diğer grafikleri elde etmek için kullanılabilir olduğunu not edin. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1:. Sıralama ve Coxiella transpozon mutantlar açıklama (a) Tek primeri koloni PCR transpozon ekleme bölgesi içeren DNA fragmanlarının büyütülmesi için kullanılmıştır. Bir yükseltme primeri (Amp), tavlama sıcaklığının sıkılık bağlı olarak spesifik ve spesifik olmayan primer olarak hem de kullanılır. (B) tek primer koloni PCR tipik sonucudur. Her Reactiilgili transpozon ekleme yeri içeren bazıları değişken boyutta fragmanlar, bir dizi üretir; bazıları rastgele yan ürünlerin düşük sıkılık PCR döngüsünün olarak güçlendirilir. (C), transpozon sekansına hibridize olan bir dizileme primeri (Sekans no) kullanımı ilgi parçalarının sekanslanmasını sağlar. (D) Sıra analiz yazılımı bakteri genomu üzerinde transposon eklemeleri otomatik şerhi verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Şekil 2:. Aksenik ve Coxiella transpozon mutantlar hücre içi büyüme (A) Pilot ekranında, biz 16 çekirdekli g 38 transposon mutantlar sıralı, izole ve ekranlı varCoxiella nokta / icm salgısı sistemi enes (kırmızı gösterilir). Her bir transpozon mutantının yaşayabilirliği belirlemek üzere (B), her biri bir büyüme aksenik kültür ortamı içinde izole bir floresan DNA interkalasyon temin edici madde etiketli kullanılarak 8 gün boyunca izlenir. (C) Her bir mutant daha sonra epitel hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Transpozon bir GFP kaset sahip olarak, hücre içi bakteri üremesi bir mikroplaka okuyucu kullanarak, Coxiella çoğaltma ile ilişkili GFP floresan varyasyonları takip ederek enfeksiyon üzerinde 7 gün izlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Şekil 3: Coxiella enfeksiyonlarının Otomatik görüntü analizi Bir ​​otomatik.çiftleşmiş epifluorışıma mikroskop görüntü üç kopya 96 oyuklu plakalar, oyuk başına 21 pozisyonları kullanılır. Görüntü analiz yazılımı segmentleri ölçümü ve analizi için her edinilen kanallarda nesneleri. Tüm durumlarda, görüntü sınır temas nesneler hariçtir. (A), Hoechst kanalı (yeşil çember), konakçı hücre çekirdekleri tanımlamak için kullanılır. (B) Bu Cy3 kanalında konak hücre konturları tanımlamak için tohum olarak kullanılmaktadır (çekirdeklerin pozisyonu mavi çember, hücre konturları yeşil vardır). (C) Cy5 kanalı LAMP1 pozitif bölmeler tanımlamak için kullanılır (yeşil daire); Sadece (kırmızı) daha önce tanımlanmış olan, hücre hatlarına dahil nesnelerin görüntü analizi için muhafaza edilir. (D), GFP kanalı (yeşil çember) Coxiella kolonilerini teşhis etmek için kullanılır. (E) LAMP1 pozitif bölmeleri ile Coxiella kolonileri ilişkilendirilmesi Coxiella belirlenmesini sağlar </em&gt; Ihtiva-eden vakuoller (CCVS); Sadece (yeşil) daha önce tanımlanmış olan, hücre hatlarına dahil nesnelerin görüntü analizi için muhafaza edilir. Hücre konturları ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi (F) enfekte olmuş hücrelerin (yalancı) belirlenmesini sağlar. 4 floresan kanal edilen (G) resim (Coxiella koloniler (yeşil), konakçı hücre çekirdekleri (mavi), konakçı hücre, plazma membranı (gri), LAMP1 pozitif bölmeleri (kırmızı) karşılık gelen) birleştirilir ve gösterim ve kalite için kullanılan Kontrol. Ölçek 10 mikron barlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4: ev sahibi yer Coxiella faktörlerin büyük ölçekli tanımlama / patojen etkileşimiyonları (A). Coxiella kolonilerin (um 2) hücre başına koloni nispi sayısı karşı çizilen ortalama alan, ilgi konusu çoğaltma ve içselleştirme fenotipleri tespit etmek. Yeşil noktalar Z-skoru&gt; -2 (önemli değil) tarafından WT Coxiella sapan fenotipleri temsil etmektedir. Pembe ve açık mavi noktalar -2 ve -4 (hafif fenotip) arasında bir Z-skoru sırasıyla çoğaltma ve içselleştirme fenotipleri temsil etmektedir. Kırmızı ve koyu mavi noktalar Z-skoru ≤ -4 (güçlü fenotipleri) ile fenotipleri temsil etmektedir. Coxiella kolonileri (B) (mikron 2) ortalama alan transpozon eklemeleri kaynaklanan sitotoksik etkisini tahmin etmek için enfeksiyon 7 gün hayatta hücreleri (enfekte ve enfekte olmayan) toplam sayısı karşısında çizilmiştir. Yeşil noktalar Z-skoru&gt; -2 (önemli değil) tarafından WT Coxiella sapan fenotipleri temsil etmektedir. Pembe noktalar sitotoksik ph temsil-2 ve -4 (hafif fenotip) arasında bir Z-skoru enotypes. Kırmızı noktalar Z-skoru ≤ -4 (güçlü fenotipleri) ile sitotoksik fenotipleri temsil etmektedir. Oklar C (C) karşılık gelen küçük harf ile gösterilen mutantlar çoğaltma, içselleştirme ve sitotoksik fenotipleri Temsilcisi görüntüleri gösterir. Her durumda, konakçı hücre çekirdekleri kırmızı olan Coxiella koloniler yeşil içindedir. Ölçek, 50 mikron barlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emKullanma&gt; Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon dolayımlı mutagenez

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...