Name: live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain
Uploaded: 2015-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

Prosedyrene for bruk av dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra The University of Toledo i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk komité ved National Institutes of Health og Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. 1. Brain Utvinning, Seksjonering og Vevspreparering <ol><li> Ofre villtype mus belastning C57BL / 6 ved dypt euthanizing med CO 2 kvelning i 5 min. Forsikre døden ved halshugging. </li><li> Rengjør museho...

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

Beskrevet her er en protokoll for fremstilling av muse-hjernevev for både live-avbildning og fluorescensmikroskopi som gir en hurtig og følsom nøye observasjon av ependymal cilia i hjernen ventriklene. Denne teknikken er ikke begrenset til den laterale ventrikkel bare; Det kan benyttes for å observere cilia i andre hjerne ventriklene. Dette avbildningsteknikk gir en live stream som ligner bevegelsen av CSF ved stråle juling i en ex vivo setting. Videre, det gir analyse av retningsbestemt bevegelse av cilia...

Cilia er sensoriske mikrotubul-baserte organeller som strekker seg fra celleoverflaten til det ekstracellulære miljø. Avhengig av mikrotubulus organisasjon kan være cilia kategoriseres i to typer - &quot;9 + 0&quot; og &quot;9 + 2&quot;. Funksjonelt, basert på deres motilitet, disse kan bli klassifisert som bevegelig eller ikke-motile cilia 1. Primær cilia er et begrep som vanligvis brukes for å betegne &quot;9 + 0« ikke-motile cilia. Disse har ni parallelle doublet mikrotubuli (angitt ved &quot;9&quot;), og et sentralt par av mikrotubuli er fraværende innenfor den sentrale skjede (betegnet med &quot;0&quot;). Imidlertid, noen &quot;9 + 0&quot; cilia, slik som nodal cilia, som regulerer embryo laterality er motile 2. På den annen side er motile cilia karakterisert, i tillegg til de ni parallelle mikrotubul dubletter, ved en ytterligere sentral par mikrotubul dubletter og forbundet med dynein motor proteiner for å lette motilitet. I tillegg har noen &quot;92 &quot;flimmerhårene som olfactory flimmerhårene er ubevegelige tre. Ependymal celler lining hjernen ventriklene og sentralkanalen i ryggmargen er preget av motile flimmerhårene som drive cerebrospinalvæsken (CSF) sammen hjernen ventriklene 4. Det overordnede målet med denne metoden er å legge til rette for å studere motile cilia dynamikk og strukturelle abnormiteter. Hjernens helse og utvikling sterkt avhengig av effektiv sirkulasjon av CSF i hjernen ventriklene. For eksempel, normal CSF strømning og væskebalanse krever normal vibrerende og funksjonell ependymal cilia 5,6, som i sin tur spiller avgjørende roller i regulering av retningsbevegelse av nerveceller og stamcelle migrasjon 7. Som sådan unormal ependymal cilia funksjon eller struktur som kan føre til unormal CSF strømning, som er forbundet med vann, en medisinsk tilstand hvor det er en unormal oppsamling av CSF i ventriklene i bregn. Dette kan dermed føre til økt intrakranielt trykk og progressiv utvidelse av hodet, kramper, tunnelsyn, og psykisk funksjonshemming 8. Fordelene ved denne teknikk i forhold til eksisterende metoder er at det er mulig for første gang å rapportere tre distinkte ependymal celletyper: I, II, og III, på grunnlag av deres unike ciliær vibrerende frekvens og slå vinkel. Disse ependymal cellene er lokalisert innenfor visse områder i hjernen ventriklene. Videre kan effektene av alder og farmakologiske midler slik som alkohol og cilostazol på å endre ependymal celletyper eller deres lokaliseringer påvises, noe som ikke var mulig før denne klassifiseringen av ependymal celler. Cilostazol er en hemmer av fosfodiesterase-3, et enzym som metaboliserer cAMP til AMP og det også regulerer intracellulær kalsium 9. Ved hjelp av høyhastighets fluorescens bildebehandling analyse tillater avbildning og kvantifisering av den unike intracellulærekalsium vibrasjons- egenskapene til ependymal celler. For eksempel, både alkohol og cilostazol vesentlig endret ependymal stråle vibrerende frekvens, så vel som de intracellulære kalsium Svingninger egenskaper, noe som i sin tur kan føre til en endring i cerebrospinalvæsken volumet erstattet med ependymal cilia 10. I sammendraget, denne teknikken var nøkkelen til å gi det første bevis på tre forskjellige typer ependymal celler med ulike kalsium vibrasjons- egenskaper. I neste avsnitt, er en detaljert steg-for-steg oversikt over prosedyren gitt, vier oppmerksomhet til vev forberedelse og håndtering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Multiciliated ependymal celler linje ventriklene i den voksne hjernen. Unormal funksjon eller struktur av ependymal flimmerhårene er assosiert med ulike nevrologiske utfall. Den nåværende ex vivo levende avbildning av motile ependymal flimmerhårene teknikk muliggjør en detaljert studie av ciliary dynamikk følge flere trinn. Disse trinnene er: mus dødshjelp med karbondioksid i henhold til protokoller fra The University of Toledo Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC); craniectomy fulgt av hjernen fjerning og sagittal hjernen disseksjon med en vibratome eller skarp kniv for å få svært tynne snitt gjennom hjerne sideventriklene, der ependymal flimmerhårene kan visualiseres. Inkubasjon av hjernens skivene i en tilpasset glass-bunnplate inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) / høy-glukose ved 37 ° C i nærvær av 95% / 5% O 2 / CO 2-blanding er viktig for å holde vevet i live underforsøket. En video av flimmerhårene juling blir deretter tatt opp med en høy oppløsning kontrast differensial forstyrrelser mikroskop. Video blir deretter analysert ramme for ramme til å beregne Ciliary vibrerende frekvens. Dette gjør tydelig klassifisering av ependymal celler i tre kategorier eller typer basert på deres ciliær juling frekvens og vinkel. Videre gir denne teknikken bruk av high-speed fluorescens bildebehandling analyse for å karakterisere den unike intracellulære kalsium vibrasjons- egenskapene ependymal celler samt effekten av farmakologiske midler på kalsium svingninger og ciliary juling frekvens. Dessuten er denne teknikken er egnet for avbildning immunofluorescens for ciliær struktur og ciliare protein lokaliseringsstudier. Dette er spesielt viktig i sykdomsdiagnose og fenotype studier. Den største begrensningen av teknikken er knyttet til reduksjon i levende bevegelige flimmerhårene bevegelse som hjernevevet begynner å dø.

Måling ependymal flimmerhårene funksjon i levende mus hjernen Metoden som beskrives i denne protokollen blir brukt for å overvåke ependymal cilia funksjon og struktur i den friske vev dissekert fra musehjerne, så vel som til å overvåke og studere cilia vibrerende frekvens. Trinnene følges for å oppnå en fullstendig eksperiment er vist i et skjematisk flytdiagram (figur 1). Det anbefales sterkt at forsøket er gjennomført innenfor en kort tidsramme for å holde bev...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Ved hjelp av høyoppløselige kontrast differensial forstyrrelser (DIC) mikroskopi, er en ex vivo observasjon av juling av motile ependymal flimmerhårene ligger innenfor muse hjernen ventriklene demonstrert av levende-avbildning. Teknikken gjør et opptak av den unike stråle juling frekvens og slo vinkel samt deres intracellulær kalsium pendling pace egenskaper.

Live-Imaging av Ependymal Cilia i sideventriklene av Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Levende Imaging av Mitosis i utviklings Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase aktivitet i de ulike regionene i Mouse Brain: ikke-radioaktive Telomerase Gjenta Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

3D modellering av sideventriklene og Histologisk Karakterisering av periventricular Tissue hos mennesker og mus

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Bruke CLARITY / CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live bildebehandling av primære hjernebarken celler ved hjelp av en 2D kultur-systemet

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Utforsker rom - avdekke anatomi av Periventricular strukturer å avsløre sideventriklene av den menneskelige hjernen

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...