Name: live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain
Uploaded: 2015-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

Os procedimentos para o uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da Universidade de Toledo, em conformidade com as orientações do Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional dos Institutos Nacionais de Saúde e do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Extração de cérebro, Seccionamento e Preparação de tecidos <ol><li> Sacrifício de tipo selvagem estirpe de ratinhos C57BL / 6 por profundamente eutanásia com <s...

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

Descrito aqui é um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato, tanto para live-imagem e microscopia de fluorescência que fornece uma observação atenta rápido e sensível dos cílios ependymal dentro dos ventrículos cerebrais. Esta técnica não é limitada apenas ao ventrículo lateral; que poderia ser utilizado para observar o cílios nas outras ventrículos cerebrais. Esta técnica de imagem fornece uma transmissão ao vivo que se assemelha o movimento do CSF por batimento ciliar num ambiente e...

Os cílios são organelos à base de microtúbulos sensoriais que se estendem a partir da superfície da célula para o meio extracelular. Dependendo da sua organização de microtúbulos, cílios podem ser classificados em dois tipos - &quot;9 + 0&quot; ou &quot;9 + 2&quot;. Funcionalmente, com base na sua motilidade, estes podem ser classificados como motilidade ou não-móveis cílios 1. Cílios é um termo comumente usado para designar &quot;9 + 0&quot; cílios não-móveis. Estes têm nove microtúbulos doublet paralelas (indicado por &#39;9&#39;) e um par central de microtúbulos está ausente no interior da bainha central (indicado por &quot;0&quot;). No entanto, alguns &quot;9 + 0&quot; cílios, cílios, como nodal, que regulam lateralidade embrião são móveis 2. Por outro lado, os cílios móveis são caracterizados, para além das nove dupletos microtúbulos paralelas, por um par central adicional de dupletos microtúbulo e com proteínas do motor associado dineína para facilitar a motilidade. Além disso, alguns &quot;92 &quot;cílios, como cílios olfatórios são não-móveis 3. Células ependimárias que revestem os ventrículos cerebrais e no canal central da medula espinhal são caracterizados por cílios móveis que impulsionam o líquido cefalorraquidiano (LCR) ao longo dos ventrículos cerebrais 4. O objetivo geral deste método é facilitar o estudo da dinâmica cílios e anormalidades estruturais móveis. Saúde e desenvolvimento do cérebro dependem fortemente a circulação eficiente de líquor dentro dos ventrículos cerebrais. Por exemplo, o fluxo de FCS normal e equilíbrio de fluidos necessitam de batimento normal e funcional cílios ependimária 5,6, o que por sua vez, desempenham papéis críticos na regulação do movimento direccional de células neuronais e migração de células estaminais 7. Como tal, a função dos cílios ependimária anormal ou estrutura pode conduzir ao fluxo CSF ​​anormal, que está associada com hidrocefalia, uma condição médica na qual há uma acumulação anormal de CSF nos ventrículos do bchuva. Isto pode, por conseguinte, causar aumento da pressão intracraniana e alargamento progressivo da cabeça, convulsões, visão em túnel, e deficiência mental 8. As vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes é que ele permitiu, pela primeira vez para relatar três tipos de células ependymal distintas: I, II, e III, com base em sua única freqüência de batimento ciliar e batendo ângulo. Estas células ependimárias são localizados dentro de certas regiões nos ventrículos cerebrais. Além disso, os efeitos da idade e agentes farmacológicos, tais como álcool e cilostazol na alterando os tipos de células ependimais ou suas localizações pode ser demonstrada, o que não era possível antes de esta classificação de células ependimais. Cilostazole é um inibidor da fosfodiesterase-3, uma enzima que metaboliza cAMP em AMP e também regula o cálcio intracelular 9. Usando a análise de imagens de fluorescência de alta velocidade permite imagens e de quantificação do intracelular exclusivoPropriedades de oscilação de cálcio das células ependimárias. Por exemplo, tanto o álcool e o cilostazol alterou significativamente a frequência de batimento ciliar ependimal, bem como as oscilações de cálcio intracelulares propriedades, que por sua vez, pode conduzir a uma mudança no volume do fluido cerebrospinal de substituição pelos cílios ependimária 10. Em resumo, esta técnica foi a chave para proporcionar a primeira evidência de três tipos distintos de células ependimais com diferentes propriedades de oscilação de cálcio. Na seção seguinte, um panorama detalhado passo-a-passo do procedimento é fornecida, prestando muita atenção a preparação do tecido e manuseio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Células ependimárias Multiciliated alinhar os ventrículos no cérebro adulto. Função ou estrutura de cílios ependimária anormal está associado com várias deficiências neurológicas. A corrente ex vivo de imagens ao vivo da motilidade técnica cílios ependymal permite um estudo detalhado da dinâmica ciliares seguir várias etapas. Essas etapas incluem: ratos eutanásia com dióxido de carbono de acordo com protocolos de The University of Animal Care Institucional de Toledo e Comitê de Uso (IACUC); craniectomia seguido por remoção do cérebro e dissecção cérebro sagital com um vibratome ou lâmina afiada para obter secções muito finas através dos ventrículos laterais do cérebro, onde os cílios ependimária podem ser visualizadas. A incubação das fatias do cérebro de uma placa com fundo de vidro personalizado contendo meio de Eagle modificado (DMEM) / alta concentração de glicose de Dulbecco a 37 ° C na presença de 95% / 5% de O2 / CO2 mistura é essencial para manter o tecido vivo duranteo experimento. Um vídeo do espancamento cílios é então gravado utilizando um de alta resolução de contraste de interferência diferencial microscópio. O vídeo é então analisado quadro a quadro para calcular a freqüência de batimento ciliar. Isso permite a classificação distinta das células ependimárias em três categorias ou tipos com base na sua freqüência de batimento ciliar e ângulo. Além disso, esta técnica permite o uso de análise de imagem de fluorescência de alta velocidade para caracterizar as propriedades únicas de oscilação de cálcio intracelulares de células ependimais, bem como o efeito de agentes farmacológicos sobre as oscilações de cálcio e a frequência de batimento ciliar. Além disso, esta técnica é adequado para imagiologia de imunofluorescência para a estrutura ciliar e localização de proteínas ciliar estudos. Isto é particularmente importante em estudos de diagnóstico da doença e fenótipo. A principal limitação da técnica é atribuída à diminuição no movimento ciliar móveis vivo como o tecido cerebral começa a morrer.

Medir a função dos cílios ependymal no cérebro do rato vivo O método descrito neste protocolo é usado para monitorar a função dos cílios ependymal e estrutura no tecido fresco dissecado do cérebro do rato, bem como para monitorar e estudar freqüência de batimento ciliar. Os passos seguidos para alcançar uma experiência completa estão descritos em um fluxograma esquemático (Figura 1). É altamente recomendável que o experimento é conduzido dentro de um curto...

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Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Usando contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia de alta resolução, uma observação ex vivo do espancamento de cílios ependymal móveis localizados dentro dos ventrículos do cérebro do rato é demonstrado pelo live-imagiologia. A técnica permite que uma gravação da frequência de batimento ciliar ângulo único e batendo bem como as suas propriedades de estimulação do cálcio intracelular oscilação.

Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

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