Name: live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain
Uploaded: 2015-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

Procedurerna för användning av djur har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) The University of Toledo i enlighet med riktlinjerna i Institutional Animal Care och användning kommittén vid National Institutes of Health och Guide för skötsel och användning av försöksdjur. 1. Brain Utvinning, Sektione och Vävnadsberedning <ol><li> Offer vildtyp musstam C57BL / 6 genom djupt euthanizing med CO2-kvävning under 5 min. Försäkra döden ge...

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

Beskrivs här är ett protokoll för framställning av musen hjärnvävnad för både live-imaging och fluorescensmikroskopi som ger en snabb och känslig noggrann observation av ependymala flimmerhår i hjärnan kamrarna. Denna teknik är inte begränsad till endast den laterala ventrikeln; det skulle kunna användas för att observera cilier i andra hjärn ventriklar. Denna bildteknik ger en live stream som liknar rörelse CSF genom ciliär stryk i en ex vivo inställning. Dessutom möjliggör den analys av r...

Cilier är sensoriska mikrotubuli baserade organeller som sträcker sig från cellytan till den extracellulära miljön. Beroende på deras mikrotubuli organisation kan cilier delas in i två typer - &quot;9 + 0&quot; eller &quot;9 + 2&quot;. Funktionellt, baserat på deras rörlighet, dessa kan klassas som rörliga eller icke-rörliga flimmerhår 1. Primär cilier är en term som vanligen används för att beteckna &quot;9 + 0&quot; icke-rörliga cilier. Dessa har nio parallella doublet mikrotubuli (betecknas med &quot;9&quot;) och en central par mikrotubuli är frånvarande i den centrala manteln (betecknas med &quot;0&quot;). Men några &quot;9 + 0&quot; cilier, såsom nodal cilier, som reglerar embryo lateralitet är rörliga 2. Å andra sidan, är motila cilier kännetecknas, förutom de nio parallella mikrotubuli dubletter, genom ytterligare ett centralt par av mikrotubuli dubletter och associerad med dynein motorproteiner för att underlätta motilitet. Dessutom är vissa &quot;9+2 &quot;Cilier såsom lukt cilier är icke-rörliga 3. Ependymala celler som bekläder ventriklar i hjärnan och den centrala kanalen av ryggmärgen kännetecknas av motila flimmerhår som driva cerebrospinalvätskan (CSF) längs hjärnans ventriklar 4. Det övergripande målet med denna metod är att göra det lättare att studera rörliga flimmerhår dynamik och strukturella avvikelser. Hjärnans hälsa och utveckling är starkt beroende av en effektiv spridning av CSF i hjärnan kamrarna. Exempelvis normala CSF-flödet och vätskebalansen kräver normalt slå och funktionell ependymceller cilier 5,6, som i sin tur spelar kritiska roller i regleringen den riktade rörelsen av neuronala celler och stamcells migrering 7. Som sådan onormal ependymala cilier funktion eller struktur kan leda till onormal CSF flöde, som är associerad med hydrocefalus, ett medicinskt tillstånd i vilket det finns en onormal ansamling av CSF i ventriklar bregn. Detta kan alltså orsaka ökat intrakraniellt tryck och progressiv utvidgning av huvudet, kramper, tunnelseende och psykisk funktionsnedsättning 8. Fördelarna med denna teknik jämfört med befintliga metoder är att det tillåtet för första gången att rapportera tre distinkta ependymal celltyper: I, II och III, baserat på deras unika ciliära slå frekvens och slå vinkel. Dessa ependymalceller är lokaliserade inom vissa regioner i hjärnan kamrarna. Dessutom kan effekterna av ålder och farmakologiska medel, såsom alkohol och cilostazol på ändring av ependymala celltyper eller deras lokaliseringar påvisas, vilket inte var möjligt innan denna klassificering av ependymalceller. Cilostazol är en hämmare av fosfodiesteras-3, ett enzym som metaboliserar cAMP till AMP och det reglerar också intracellulär kalcium 9. Använda hög hastighet fluorescens bildanalys kan avbildning och bestämning av den unika intracellulärakalcium svängnings egenskaperna hos ependymalceller. Till exempel, både alkohol och cilostazol ändras avsevärt ependymceller ciliära slå frekvens samt de intracellulära kalcium svängningar egenskaper, vilket i sin tur kan leda till en förändring i cerebrospinalvätskan volymersättning med ependymal flimmerhår 10. Sammanfattningsvis denna teknik var nyckeln till att ge det första beviset på tre distinkta typer av ependymala celler med olika kalciumsvängningsegenskaper. I följande avsnitt är en detaljerad steg-för-steg-översikt över förfarandet, ägnar stor uppmärksamhet åt förberedelser och hantering vävnad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Multiciliated ependymalceller linje kamrarna i den vuxna hjärnan. Onormal funktion eller struktur ependymala cilier är förknippad med olika neurologiska underskott. Den nuvarande ex vivo levande avbildning av rörliga ependymala flimmerhår teknik möjliggör en detaljerad studie av ciliära dynamik efter flera steg. Dessa steg inkluderar: möss eutanasi med koldioxid enligt protokoll från The University of Toledos Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC); craniectomy följt av hjärnan bort och sagittal hjärnan dissektion med en vibratome eller vass kniv för att få mycket tunna snitt genom hjärnan laterala ventriklarna där ependymceller cilier kan visualiseras. Inkubation av hjärnans skivor i en anpassad glasbottnad platta innehållande Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) / hög-glukos vid 37 ° C i närvaro av 95% / 5% O2 / CO 2 blandning är viktigt att hålla vävnaden vid liv underexperimentet. En video av flimmerhåren slå sedan spelats in med en hög upplösning differential interferens kontrast mikroskop. Videon är sedan analyseras ruta för ruta för att beräkna strålkroppen slå frekvensen. Detta möjliggör exakt klassificering av de ependymala celler i tre kategorier eller typer baserat på deras ciliära stryk frekvens och vinkel. Dessutom tillåter denna teknik användningen av höghastighets fluorescens bildanalys för att karaktärisera de unika intracellulära kalciumsvängningsegenskaper ependymalceller samt effekten av farmakologiska medel på kalcium svängningar och strålkroppen slå frekvensen. Dessutom är denna teknik lämpar sig för immunofluorescens avbildning för ciliär struktur och ciliär proteinlokaliseringsstudier. Detta är särskilt viktigt vid diagnos och fenotyp sjukdomsstudier. Den största begränsningen av tekniken tillskrives minskningen i levande rörliga cilier rörelsen som hjärnvävnaden börjar dö.

Mätning ependymal flimmerhår funktion i levande mushjärna Den metod som beskrivs i detta protokoll används för att övervaka ependymal flimmerhår funktion och struktur i den friska vävnaden dissekeras från mushjärna samt att övervaka och studera flimmerhår slå frekvens. Stegen följas för att åstadkomma en fullständig experiment visas i ett schematiskt flödesschema (Figur 1). Det rekommenderas starkt att försöket genomförs inom en kort tidsperiod för att ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Använda högupplösta differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, är en ex vivo observation av misshandeln av rörliga ependymala cilier ligger inom mus hjärnventriklarna framgår av levande avbildning. Tekniken möjliggör en inspelning av den unika ciliära slå frekvens och slå vinkel samt deras intracellulära kalcium svängning stimuleringsegenskaper.

Live avbildning av ependymala Cilia i de laterala ventriklama i mushjärna

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulering och mitokondriell Transport: Bildproduktion i hippocampus nervceller under långa löptider

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Manuell dränering av zebrafisk embryonala ventriklar i hjärnan

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live avbildning av Mitos i utvecklings Mouse embryonala Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerasaktivitet i de olika regionerna i Mouse Brain: Ej Radioaktiv Telomeras Upprepa Amplification Protocol (TRAP) analys

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

3D-modellering av de laterala ventriklama och Histologisk karakterisering av periventrikulär Tissue i människor och mus

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live avbildning av primära hjärnbarken celler använder ett 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Utforska rymden - avtäckning anatomi periventrikulär strukturer att avslöja de laterala ventriklarna i den mänskliga hjärnan

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...