Name: in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx Research Grant&quot; og &quot;Sporta forskning Grant&quot; for Pediatric Cardiology, UZ Leuven, Belgien (JC); Center for Molekylær og Vascular Biology er støttet af Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), med &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) fra University of Leuven og en forskningsbevilling fra Boehringer-Ingelheim.

Dyreforsøg blev godkendt af Etisk Komité KU Leuven. 1. Forberedelse Bakterier til in vitro perfusionsopløsning og in vivo forsøg <ol><li> Vi brugte S. aureus stamme Newman for alle eksperimenter, der er beskrevet i dette manuskript. S. aureus Newman blev opbevaret i Brain Heart Infusion (BHI) med 10% glycerol ved -80 ° C. </li><li> Brug en steril løkke for at skrabe de frosne bakterier fra og inokulering i 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB) O / N ved 37 ° C (OD600&gt; 3). </li><li> Vaske bakterierne ved centrifugering (2.600 g, RT, 5 min) og resuspender bakterielle pellet i 5 ml PBS (phosphatpufret saltvand). </li><li> Der fremstilles en opløsning af 5 (6) -carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidylester (carboxy-fluorescein) i ethanol 1 mg / ml. 1 mg / ml carboxy-fluorescein opløsning til 150 ug / ml i laboratoriekvalitet vand (f.eks MilliQ vand) fortyndes. Beskytte rørene fra lettemed aluminiumsfolie og opbevares ved -20 ° C. </li><li> Centrifugeres bakterierne (2.600 xg, RT, 5 min). Resuspender den bakterielle pellet i 800 pi PBS, og der tilsættes 200 pi (slutkoncentration på 30 ug / ml for perfusion eksperimenter) eller 400 pi (slutkoncentration 50 ug / ml for in vivo forsøg) af 150 pg / ml carboxy-fluorescein opløsning. Beskytte rørene mod lys med aluminiumfolie og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur på en ryster. </li><li> Efter mærkning blok med 6% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. </li><li> Fortynd bakterier bruger optisk densitometri (OD), en OD600 på 0,65 for in vitro-forsøg (svarende til ca. 3 x 10 8 kolonidannende enheder (CFU) / ml for S. aureus) og en OD 600 på 1,8 til in vivo forsøg ( svarende til ca. 1 x 10 9 CFU / ml for S. aureus) i PBS. Beskyt rørene mod lys med alufolie og lad på is. </li></ol> 2. In Vitro Perfusion Eksperimenter <ol><li> Coating af dækglas <ol><li> Fortynd von Willebrand faktor (vWF) (Haemate P, stock koncentration 2.400 pg / ml) i laboratoriekvalitet vand (deioniseret destilleret) til en slutkoncentration på 50 ug / ml. </li><li> Fortynd collagen i isotonisk glucoseopløsning (SKF opløsning, pH 2,7-2,9, som leveret af fabrikanten) til en slutkoncentration på 160 ug / ml. </li><li> Coat dækglas (24 × 50 mm) med VWF eller collagen ved at droppe 200 pi af overtrækket på parafilm og placere dækglasset oven på dråben. Dråben vil spredes langs overfladen af ​​dækglasset. </li><li> Inkubere dækglasset i en befugtet beholder i 4 timer ved stuetemperatur. Løft forsigtigt dækglassene fra parafilm med en stump nål. Montere dækglasset i den nederste del af strømningskammeret. </li></ol></li><li> Coating af plast Slips med endotelceller <ol><li> Coat plast glider(1-brønds PCA cellekulturkammer, Sarstedt, Tyskland) med 1 ml af en 1% gelatine i PBS og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Seed humane navleveneendotelceller (HUVEC&#39;er) på gelatineovertrukne plast glider og dyrke dem til 70-80% konfluens. Montere plastik slip i den nederste del af strømningskammeret. </li></ol></li><li> Perfusion Experiment BEMÆRK: En skematisk oversigt over in vitro perfusion model er vist i figur 1. <ol><li> Udføre in vitro bakteriel adhæsion studier i en mikro-parallel plade flow kammeret ved en laminar forskydningsspænding mellem 2,5 dyn / cm2 og 20 dyn / cm2 for at simulere forskellige fysiologiske strømningsforhold. </li><li> Strømningskammeret (in-house design) består af en metalramme og en perfusion kammer lavet af plexiglas (poly (methyl) methacrylat (PMMA)). Ved at tilslutte den til en høj nøjagtighed infusionspumpe (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA), kan vi generere strøm rates mellem 0,0001 pl / min og 220,82 ml / min. </li><li> Tilslut slangen til den øvre del af strømningskammeret og injicere medium i slangen. Anbring forsigtigt den øvre del af strømningskammeret oven på bunddelen og samle strømningskammeret. Vær omhyggelig med at undgå luftbobler. Injicer 1 ml medium gennem kammeret for at sikre, at kammeret ikke lækker, og for at fjerne overskydende belægning løsning. Undgå luftbobler. </li><li> Placer musen på en termo-kontrolleret varmepude ved 37 ° C på et mikroskop bakke. Da dette er en terminal procedure, er der ikke behov for strenge asceptic procedurer. Lave et snit i nærheden halsvenen, forsigtigt fjerne højre af den cervikale muskler og isolere halsvenen fra det omgivende væv. </li><li> Opsætning af infusionspumpe og fluorescens mikroskop. Infusionspumpe indstillinger afhænger af diameteren sprøjten og den ønskede flow (se afsnit 2.4). Fra nu af arbejder i et mørkt rum. </li><li> VWF Coating: <ol><li> Fyld en sprøjte med fluorescensmærkede bakterier og tilslut den til indløbsrøret. Undgå luftbobler. Start infusionspumpen i 10 min. Infusionen afhænger af forskydningshastigheden og overtrækket, bakterier og medie, der anvendes, og skal repræsentere det steady state af adhæsion. </li><li> Efter 10 minutter vaskes væk ubundne bakterier ved at forbinde en sprøjte med PBS til indløbsrøret og starte infusionspumpen. </li><li> Tage mindst 15 billeder eller film på forskellige steder efter vaskeprocessen. Bakterier er små og potentielt vanskeligt at fokusere på. Forud for in vitro flow eksperiment, kan den relevante brændplanet hentes ved at anbringe en dråbe af fluorescensmærkede bakterier på et dækglas og placere dækglasset i strømningskammeret. Derefter søge efter den relevante fokalplan og gemme indstillingerne. BEMÆRK: Under in vitro flow eksperiment, opfange billederne under vasketrinnet (± 5 min efter start) sikrer, at kun designal for vedhængende bakterier fanget. </li></ol></li><li> Collagen Coating: <ol><li> Tilføj 60 pg / ml VWF til fluorescens-mærkede bakterier lige før du starter perfusion. Fyld en sprøjte med fluorescensmærkede bakterier eller fluorescens-mærkede bakterier suppleret med 60 pg / ml VWF og tilslut det til indløbsrøret. Undgå luftbobler. Gentag trin 2.3.5.2 til 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Endotelceller: <ol><li> Aktivere endothelcellerne ved perfusion med en 0,1 mM opløsning af Ca2 + -ionophore A23187 (stamopløsning 10 mM opløst i dimethylsulfoxid (DMSO)) i DMEM ved den samme forskydningshastighed som det bakterielle perfusion i 10 min ved perfusion med en 0,1 mM. Gentag trin 2.3.5.2 til 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Beregne shear rate og forskydningsspænding som følger. Forskydningshastighed = 6Q / wh 2 Hvor: Q: flow rate i ml / min, w: bredde i cm, h: højde i cm Forskydningsspænding (τ) = shear rotteex viskositet (μ) Hvor μ: medium: 0,01 dyn x sek / cm2, fuldblod: 0,04 dyn x sek / cm2 </li><li> Billedanalyse <ol><li> Opnå levende billeder med et omvendt fluorescens mikroskop med en sort og hvid kamera og udvikle bruge imaging software. Brug eksponeringstid på 1,5 sek. Tage flere snapshots (mindst 15) tilfældigt spredt over den coatede overflade af flowet kammeret og gemme dem i den relevante filformat. </li><li> Udføre billedanalyse med ImageJ. Trække baggrunden for at fjerne glatte kontinuerlige baggrunde fra billedet (Proces - subtrahere Background) og definere tærsklen til at indstille nedre og øvre grænseværdier, segmentere gråskalabilleder i træk af interesse. Måle arealet begrænset til tærskelværdien. </li><li> Sammenligne bakteriel adhæsion, udtrykt som fluorescerende område, fx ved hjælp af statistisk analyse software. Sammenlign grupperne ved hjælp af envejs ANOVA eller two-tailed Students t-test. Rapportere alle værdier som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM). Overvej en p- værdi på &lt;0,05 signifikant (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. In vivo Mesenterisk Perfusion Model <ol><li> Forberedelse / operation af musen <ol><li> Fast musen natten før eksperimentet for at begrænse afføring. </li><li> Giv en 6-8 uger gamle mus (C57BL / 6) præoperativ analgesi ved en subkutan injektion af buprenorphin (0,1 mg / kg legemsvægt (BW)) 20-30 minutter før operationen. </li><li> Bedøver musen ved intraperitoneal injektion af ketamin (125 mg / kg legemsvægt) og xylazin (12,5 mg / kg legemsvægt). Kontroller ved pedal refleks. Anvend dyrlæge salve for at forhindre tørhed. </li><li> Placer musen på en termo-kontrolleret varmepude ved 37 ° C på et mikroskop bakke. Da dette er en terminal procedure, er der ikke behov for streng asceptic procedurer. Lave et snit i nærheden halsvenen, forsigtigt fjerne højre af den cervikale muskler og isolere halsvenen fra det omgivende væv. </li><li> Indsætte et 2 French intravenøst ​​kateter i den højre halsvene til infusion af fluorescensmærkede bakterier eller andre opløsninger. Åbne bughulen via en midtlinje abdominal incision og bruge vatpinde til at sprede mesenteriet og at visualisere mesenteriske arteriolær og venular cirkulation. </li><li> Placer musen på den højre side på en transparent plade og fastgør kanylen med tape. Brug en varm pack at forhindre hypotermi. For at undgå dehydrering af vævet, drop 500 pi 0,9% NaCl på tarmene. </li></ol></li><li> Fluorescens mikroskopi af bakteriel adhæsion til mesenteriske cirkulation <ol><li> Arbejde i et mørkt rum. Brug vatpinde til at immobilisere skibene og visualisere dem under et omvendt mikroskop. </li><li> Topisk anvendelse 5 pi af en 10 mM opløsning of Ca2 + -ionophore A23187 opløst i DMSO. Efter 10 sek, injicere 100 pi mærket bakterier (se trin 1) gennem jugularis kateter. Tag time-lapse billeder. Efter eksperimentet er færdig, aflive musen efter institutionelle godkendte retningslinjer. </li></ol></li><li> Billedanalyse <ol><li> Opnå levende billeder ved hjælp et omvendt fluorescensmikroskop, taget med en sort og hvid kamera og udviklet ved hjælp af en imaging software. Anvende automatiseret eksponeringstid og kontrast optimering specifikke for det anvendte udstyr. </li><li> Anskaf time-lapse billeder ved hjælp af &#39;Acquisition&#39; værktøj på værktøjslinjen (Multidimensional Acquisitions - Time) ved hjælp af 40 cykler af 1.000 billeder / sek. Gemme billederne i et passende billedfil format. </li><li> Proces billeder ved hjælp ImageJ analyse software til at måle arealet af fluorescerende signal per billede. Definer tærsklen til at indstille nedre og øvre grænseværdier, segmentere gråtoner billeder i fpræinstalleret af interesse. Identificere området af interesse (blodkar), og måle arealet begrænset til tærskelværdien og området af interesse. Sammenligne bakteriel adhæsion, udtrykt som fluorescerende område ved hjælp af en statistisk eller graftegning software. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid/endothelial+cell+interaction+under+shear+stress.">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li><li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Willebrand+factor-binding+protein+(vWbp)+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase.">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li><li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation.">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation.">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections.">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li><li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Shear stress er en afgørende faktor for den tidlige bakteriel adhæsion til karvæggen og til den efterfølgende generation af endovaskulær eller endokardiale vegetations og metastatiske infektioner 4,5. Vi beskrev komplementære in vitro og in vivo modeller til at studere patogenesen af endovaskulære infektioner under fysiologiske forskydningsspænding. Disse modeller har tilladt os at identificere von Willebrand-faktor-bindende protein (vWbp) som den største S. aureus-protein til at interagere under strømning med en skadet karvæggen udsætter VWF 4. Endovaskulære infektioner og endocarditis i særdeleshed, er bekymrende, ikke kun på grund af sepsis-induceret svigt og død orgel, men også på grund af de lokale og fjerne (&quot;metastatiske&quot;) komplikationer. At forårsage endocarditis og metastatiske infektioner, bakterier er nødt til at holde sig til karvæggen og dermed modstå forskydningsspænding af strømmende blod. Meststudier af bakterier virulensfaktorer er blevet udført i statiske forhold. Dog kan disse etablerede interaktioner ikke modstå forskydningskræfter og undersøgelser under strømningsforhold kan afsløre nye, hidtil ikke erkendte faktorer i bakterie-vært samspil. Med micro-parallel flow kammer, har vi og andre vist betydningen af ​​VWF for vaskulær vedhæftning. Under forskydningsspænding, VWF gradvist folder sig ud fra dens hvilested kugleformet struktur, og udsætter A1 domæne der interagerer med blodplader via sin GPIb receptor 6. Strømningskamre har været flittigt brugt til at studere trombocytfunktionen 7. Bemærkelsesværdigt, også S. aureus adhæsion under strømning kræver VWF, særlig A1-domæne, som er blotlagt ved forskydning. Vi identificerede vWbp at mægle VWF binding. vWbp er en koagulase der bidrager til S. aureus patofysiologi ved at aktivere værtens prothrombin. Staphylothrombin, RESulting kompleks af en bakteriel koagulase og prothrombin, omdanner fibrinogen til uopløseligt fibrin 8,9. Vores undersøgelser har vist, at vWbp ikke kun aktiverer prothrombin, men udløser dannelsen af bakterier-fibrin-blodplade aggregater, som forøger adhæsion til blodkar under flow 4,10,11. In vitro flow kammer model giver mulighed for at studere de forskellige aktører i bakteriel adhæsion til cellulære eller matrixkomponenter. Bakterielle virulensfaktorer kan studeres ved at anvende mutanter eller uskadelige bakterier udtrykker specifikke overfladeproteiner. Alternativt kan der tilsættes farmakologiske inhibitorer eller blokerende antistoffer til mediet i strømningskammeret. Den rolle, som værten faktorer som forskellige bestanddele af ekstracellulær matrix kan studeres ved at anvende dækglas med forskellige belægninger. Dækglassene kan også dækkes med endothelceller, hvoraf status aktivering kan moduleres ved at tilføje specifikke stimulatorer. Apart fra karvæggen, kan bidraget fra værten blodlegemer og plasmaproteiner blive undersøgt ved at tilsætte disse faktorer for at det strømmende medium. Således kan forskellige betingelser med stigende kompleksitet undersøges under standardiserede betingelser for laminar strømning at trævle de interaktioner, der tillader bakterier til at klæbe til karvæggen in vivo. Interaktioner identificeret i in vitro-model efterfølgende undersøgt i en dyremodel for at teste deres relevans i en kompleks organisme. Andre in vivo modeller til at studere dynamiske interaktion under flow er blevet beskrevet, såsom hamster dorsale skinfold kammer 12 og cremaster model 13. Til sammenligning mesenteriske perfusion model her beskrevne giver flere fordele på grund af dets brugervenlighed, muligheden for at variere vært genetiske baggrund af musene og evaluere farmakologiske interventioner. Som konklusion beskrevne modellergiver mulighed for at studere overfladeproteiner ikke kun af S. aureus, men mange andre mikroorganismer i forskellige vært baggrunde, for bedre at forstå patogenesen af vaskulære infektioner.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

For at bevirke endovaskulære infektioner og endocarditis, bakterier skal være i stand til at klæbe til karvæggen, medens den udsættes for forskydningsspændingen af ​​strømmende blod. At identificere de bakterielle og vært faktorer, der bidrager til vaskulær vedhæftning af mikroorganismer, der egnede modeller, der studerer disse interaktioner under fysiologiske forskydningsbetingelser nødvendig. Her beskriver vi en in vitro strømningskammeret model, der tillader at undersøge bakteriel adhæsion til forskellige komponenter i den ekstracellulære matrix eller til endotelceller, og en intravital mikroskopi model, der blev udviklet til at direkte visualisere den indledende adhæsion af bakterier til den splanknisk cirkulation in vivo . Disse metoder kan anvendes til at identificere de bakterielle og vært faktorer er nødvendige for adhæsion af bakterier under flow. Vi illustrerer relevansen af forskydningsspænding og den rolle, von Willebrand faktor for adhæsionen af Staphylococcus aureus under anvendelse af både in vitro og in vivo-model.

S. aureus adhæsion til VWF, subendoteliale matrix og endotelceller er en forskydningsspænding afhængig fænomen For at understrege betydningen af forskydningsspænding i samspillet mellem S. aureus og VWF udførte vi perfusioner flere end VWF overtrukne dækglas ved forskellige forskydningshastigheder (en skematisk oversigt over in vitro perfusion modellen er givet i figur 1. Adhæsion af S. aureus til vWF steg med stigende forskydningshastigheder fra 250 sek-1 til 2.000 sek-1 (figur 2), hvilket indikerer, at høje forskydningskræfter ikke hæmmer, men forstærke adhæsionen af bakterier til VWF. For at undersøge bidraget af VWF til bakteriel adhæsion til kollagen, den vigtigste komponent i den subendoteliale matrix, vi perfunderet fluorescensmærket S. aureus løbet kollagen i nærvær eller fravær af VWF. I fravær af VWF, adhæsion af S. enureus til collagen faldt med stigende forskydningshastigheder. Men når VWF var til stede i mediet, adhæsionen af S. aureus steg med stigende forskydningshastigheder (figur 3). In vitro flow-model gør det også muligt for os at undersøge adhæsion af bakterier til endotelceller under flow. Vi perfunderet HUVEC&#39;er med fluorescensmærket S. aureus ved forskydningshastigheder fra 500 til 2.000 sek-1. Hvor angivet, blev HUVEC&#39;er aktiveret med en Ca2 + -ionophore, at forårsage frigivelse af VWF. Endotelcelleaktivering og den efterfølgende VWF frigivelse, forøget adhæsion af S. aureus (figur 4A), som dannede typiske &quot;string-lignende&quot; mønstre af fluorescens-mærket bakterielle klynger aligned i retning af forskydningskraft (figur 4B), hvilket tyder bindingen af bakterier langs en ​​lineær-strakt VWF molekyle. Indledende in vivobakteriel adhæsion i splanknisk vener medieres af VWF Da S. aureus er i stand til at overholde VWF brugte vi vildtypemus (vWF + / +) og VWF-deficiente mus (vWF - / -) for at undersøge bakteriel adhæsion til aktiverede karvæg in vivo. Real-time videomicroscopy af splanknisk vener tillod in vivo visualisering af cirkulerende fluorescensmærkede S. aureus (Skematisk oversigt over in vivo perfusion model er vist i figur 5). Efter farmakologisk aktivering af endotelet ved Ca2 + -ionophore observerede vi hurtig lokal akkumulering af individuelle bakterier og aggregater af bakterier til karvæggen af WT-mus (supplerende videoer 1 og 2). Næsten ingen adhæsion af bakterier blev observeret på det aktiverede karvæggen af vWF -deficient-mus (supplerende Video 3) i forhold til vedhæftning i WT-mus (figur 6). Fraværet af VWF nedsætter evnen hos S. aureus at holde sig til den aktiverede karvæggen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figur 1. Et skematisk fremstilling af in vitro-flow model. In vitro flow model er en multifunktionel model, der tillader undersøgelse af forskellige forskydningshastigheder afhængige mekanismer såsom bakteriel adhæsion til subendoteliale matrix, men også trombedannelse. Mikro-parallel strømningskammeret er placeret på et dækglas (plastik eller glas) med forskellige belægninger af proteiner og endotelceller. Adhæsionen af ​​forskellige bakterier (orange og grå prikker) kan analyseres, og virkningen af ​​tilstedeværelsen af ​​plasmaproteiner, blodplader og helblod kan evalueres. Fluorescerende markører for blodplader (blå ovaler) eller fibrinogOr (blå strenge) kan anvendes i kombination med forskellige inhibitorer (sorte ovaler) at skelne bakterielle og værtsfaktorer. Repræsentative billeder af bakteriel adhæsion af S. aureus til collagen belægning i nærværelse (nederst) eller fravær (øverst) på VWF er vist (skala bar er 100 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figur 2. Adhæsion af S. aureus til VWF stiger med stigende forskydningshastigheder. Micro-parallel strømningskammeret perfusion løbet coated VWF (50 ug / ml) med fluorescensmærket S. aureus Newman ved forskydningshastigheder på 250 til 2.000 sek -1 (sek -1) i medium (n&gt; 5). Alle resultater er udtrykt som middelværdi ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figur 3. Adhæsion af S. aureus til subendotel er forskydning og VWF afhængig. Micro-parallel flow kammer perfusion i coated kollagen (160 pg / ml) med fluorescens-mærket S. aureus Newman ved forskydningshastigheder på 250 til 2.000 sek -1 i medium (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) var til stede i mediet er angivet. Alle resultater er udtrykt som middelværdi ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figur 4. Adhæsion af S. aureus til aktiverede endotelceller er shear afhængig. Micro-parallel strømningskammeret perfusion i endotelceller. (A) Human navlestrengsveneendotelceller blev aktiveret med Ca2 + -ionophore A23187 (0,1 mM) efterfulgt af en 10 min perfusion af fluorescens-mærket S. aureus Newman ved forskydningshastigheder på 500 til 2.000 sek -1 i medium (n&gt; 5). Alle resultater er udtrykt som middelværdi ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Billede af mikro-parallel flow kammer perfusion over aktiverede HUVEC&#39;er med S. aureus ved en forskydningshastighed på 1000 sek -2. S. aureus danner strenge af ± 200 mikron længde, hvilket tyder vedhæftning til VWF multimerer (skala bar er 100 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figur 5. En skematisk oversigt over in vivo mesenterisk perfusion model. En ret halsvene kateter (gul linje) er indsat for administrationen af fluorescently mærkede bakterier (orange prikker), yderligere bedøvelsesmidler eller andre komponenter såsom farmaceutiske inhibitorer og antistoffer. Bughulen åbnes, og mesenteriet spredes at visualisere blodkar (venøse og arterielle) under et fluorescensmikroskop. Efter farmakologisk aktivering af endotelet ved en Ca2 + -ionophore, der inducerer frigivelsen af VWF, kan bakterier injiceres gennem halsvenen kateter. Real-time intravaskulær video mikroskopi tillader in vivo visualisering af cirkulerende fluorescens-mærkede bakterier og den deraf dannelse af bakterier-blodpladetromber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figur 6. Den indledende adhæsion af S. aureustil aktiveret endotel in vivo medieres af VWF In vivo venøs mesenteriske perfusion model med C57BL / 6- vWF + / + og C57BL / 6- vWF -. / - mus. Adhæsion af fluorescensmærkede S. aureus til den lokalt aktiveret karvæggen er betydeligt lavere i vWF - / - mus. Alle resultater er udtrykt som middelværdi ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Video Figur 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: Real-time vedhæftning af S. aureus til aktiveret karvæggen i vWF + / + mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Klik her for at se denne video.</a> Video 2: Real-time aggregatdannelse og embolisering af S. aureus i vWF + / + mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Klik her for at se denne video.</a> <img alt="Video Figur 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: Real-time vedhæftning af S. aureus til aktiveret karvæg i vWF - / -. mus In vivo mesenteriske perfusion model med vWF + / + og vWF - / - mus. Fem pi af en Ca2 + -ionophore (10 mM) var ansøged til området af det visualiserede vaskulære leje. En suspension af carboxy-fluorescein-mærket S. aureus blev injiceret gennem jugularis kateter. Den mesenteriske cirkulation blev visualiseret under et omvendt mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Klik her for at se denne video.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro og in vivo model til at studere bakteriel adhæsion til karvæggen Under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering af Humane navlevene-endotelceller og deres anvendelse i undersøgelsen af ​​neutrofil transmigration Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humaniseret Mouse Model til Study bakterieinfektioner Målretning mikrovaskulaturen

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vedhæftning Assay til at studere Leucocyte Rekruttering til human hepatiske Sinusformede endotel Under betingelser for forskydningsspænding

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse af Vedhæftning Under Shear Stress for Studiet af T-lymfocyt-adhæsionsmolekyle Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspression og oprensning af mennesket<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...