Name: isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

ШФЛУ при поддержке университета перинатального инициативы Wayne State в материнской, перинатальной и детского здоровья. Мы выражаем глубокую признательность Морин McGerty и Эми Е. Furcron (Wayne State University) за их критическое прочтение рукописи.

Перед началом работы с образцами, указанных в этом протоколе, животное этическое одобрение должно быть дано комитетом по этике местного научно-исследовательского и организационного обзора советов по. При работе с кровью животных, клетки, или опасных веществ, упомянутые в настоящем пр?...

Коллекция согласованных данных, которая записывает обилие и фенотипические характеристики Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода имеет важное значение для понимания патогенеза осложнений, связанных с беременностью. Несколько методов было описано, что облегчать отделен...

Иммунная толерантность во время беременности период, когда отличительные изменения происходят в иммунной системе матери. Эти изменения позволяют мать терпеть плод, полу-аллогенную трансплантата 1. Плод выражает отцовской главного комплекса гистосовместимости (МНС) антигены 2 и фетальные клетки были обнаружены в материнском кровотоке 3; Однако, плод не отторгается 4,5. Это загадка полностью не поняты. Самая недавняя гипотеза утверждает, что толерантность материнского плода создается во время полового акта и оплодотворения 6,7 и поддерживается выдержать полный срок беременности 8-10. Разбивка этой материнской плода толерантности считается механизм заболевания на ранних и поздних стадиях беременности 10-16. Допуск матери и плода включает в себя участие различных лейкоцитов групп населения, в том числе Т-клеток (регуляторных Т-клеток, клеток Th1, Th2 клеток, и клетки Th17), Macмакрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, NK-клетки, и НКТ-клеток, дендритные клетки, В-клетки и, что изменения в плотности и локализации во время беременности 15,17-19. Допуск матери и плода обогащается на материнской плода интерфейс 20 - анатомической месте, где иммунная система матери взаимодействует с антигенами плода 20,21. Интерфейс материнской плода создается во время плаценты, когда эмбриональные клетки трофобласта extravillous вторгнуться слизистой оболочки матки 22-24. На стороне плода этого интерфейса, мембраны, окружающие плод создать специализированный эпителиальной поверхности в плаценте, и syncytiotrophoblast клетки контролировать обмен питательных веществ через их непосредственном контакте с материнской кровью 22. По материнской стороне интерфейса, децидуальной набирает гетерогенную пул лейкоцитов у мышей, которые составляют 30% до 50% всех клеток плаценты. В дополнение к их участию в Матерналь иммунной толерантности, эти клетки являются главными участниками различных процессов во время беременности., например, защиты репродуктивного тракта от инфекций, оплодотворения, имплантации эмбриона 7,25, децидуальный ангиогенез 26, ремоделирование сосудов 24,27, трофобласт вторжение 28, плацентарный Развитие 24,25, и, в итоге, труда и доставка 15,17. Таким образом, изучение лейкоцитов, участвующих в толерантности материнской плода имеет важное значение для выяснения патогенеза осложнений, связанных с беременностью. Хотя использование иммуногистохимии и иммунофлуоресценции породила данные для непосредственной визуализации и локализации матки, плаценты, или плацентарных лейкоцитов 29,30, проточной цитометрии анализа показали еще более конкретные субтипов лейкоцитов в каждой из этих тканей 31,32. Кроме того, проточной цитометрии был использован для определения плотности и часть оболочкинал плода интерфейс лейкоциты 33 и уровни экспрессии внеклеточных и внутриклеточных белков 8-10,34. Проточной цитометрии анализ лейкоцитов на границе материнской плода требует одного суспензии клеток. Для того, чтобы изолировать Лейкоциты проникают из децидуальной, матки, плаценты и тканей, были использованы два метода ткани диссоциации: механическая и ферментативная. Оба метода позволяют разделение проникших лейкоцитов из внеклеточного матрикса (ЕСМ) этих тканей. Ферментативный диссоциации ткани превосходит механической ткани диссоциации, так как позволяет более высокий выход лейкоцитов с менее сдвига силы ассоциированного повреждения 35. Следовательно, механическая ткани диссоциации требует объединения тканей 36, которые могут увеличить изменчивость и неоднородность образцов. Тем не менее, механической диссоциации может быть выбор, когда представляющий интерес антиген может быть изменена путем ферментативной диссоциации или, когда функциональные клеткис процентной необходимости быть сохранены (например., цитотоксичность NK клеток) 35. Использование протеолиза с конкретными ферментами, чтобы ухудшить ECM исключает низкие выходы, наблюдаемые с механической диссоциацией. Некоторые исследования показали использование трипсина 32, 37, коллагеназы ДНКазы 31 диспазу 38 и коммерческих коктейлей различных ферментов 32,39. Однако природа и концентрация различных ферментов и продолжительность пищеварения должны быть тщательно определена и подтверждена, чтобы гарантировать поддержание целостности клеточных поверхностных антигенных эпитопов, необходимых для иммунофенотипирования. Различные структуры поверхности дифференциально восприимчивы к разрушению различными ферментами, с некоторыми ферментами, такими как трипсин, будучи известно, для зачистки поверхности лейкоцитов эпитопы, распознаваемые многих моноклональных антител. Введенный здесь, представляет собой способ, использующий proteolytIC и коллагенолитической ферментативная коктейль, названный Accutase. Это решение ферментативного нежно достаточно в то же время эффективно диссоциации мышиных тканей на границе материнской плода, и не требует добавления других реагентов или диссоциирующих сыворотки, чтобы закончить реакцию диссоциации. Кроме того, он готов для использования в качестве подается и, хотя время диссоциации должно быть подтверждено, что более надежными, чем вышеуказанных ферментов 40,41. Использование комбинации обоих типов тканей дезагрегации улучшает качество и количество клеток, полученных; Таким образом, несколько исследований реализованы комбинированное применение механической и ферментативной диссоциации с удовлетворительными результатами 31,32,37. Протокол, описанный здесь, был создан и утверждена в нашей лаборатории; он использует комбинацию мягкого механического диссоциации с последующим надежной ферментативной дезагрегации. Этот протокол позволяет изоляции и дальнейшее изучениев проникают лейкоциты в мышиных тканях на границе материнской плода (матка, децидуальной и плацента). Следующий протокол также поддерживает целостность маркеров клеточной поверхности и доходности достаточно жизнеспособных клеток для последующих применений, как показано с помощью анализа проточной цитометрии. Наконец, этот протокол поддерживает согласованность клеточного препарата для анализа и сравнения различных мышиных тканях, составляющих интерфейс материнской плода.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Иммунная толерантность во время беременности требует, чтобы иммунная система матери претерпевает изменения отличительные для того, чтобы принимать и лелеять развивающегося плода. Эта терпимость начинается при половом акте, созданы во оплодотворения и имплантации, и поддерживается на протяжении всей беременности. Активные клеточные и молекулярные медиаторы толерантности материнской плода обогащены в месте контакта между плода и материнской тканей, известных как материнской плода интерфейс, который включает в себя плаценту и матки и децидуальной ткани. Этот интерфейс состоит из стромальных клеток и инфильтрацией лейкоцитов, и их обилие и фенотипические характеристики меняются в течение беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода включают нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки, Т-клетки, В-клетки, NK-клетки и NKT клетки, которые вместе создают локальную микросреду, которая поддерживает беременность. Дисбаланс между этими клетками или любой inappropетел изменение в их фенотипов считается механизм болезни во время беременности. Таким образом, исследование лейкоцитов, которые проникают интерфейс материнской плода необходимо для того, чтобы выяснить иммунных механизмов, которые приводят к осложнениям, связанных с беременностью. Описанный здесь протокол, который использует комбинацию нежной механической диссоциации с последующим надежной ферментативной дезагрегации с протеолитической и коллагенолитического ферментативной коктейль, чтобы изолировать Лейкоциты проникают из мышиных тканей на границе материнской плода. Этот протокол позволяет изоляции высокой численности жизнеспособных лейкоцитов (&gt; 70%) с достаточно консервативными антигенных и функциональные свойства. Изолированные лейкоциты могут быть проанализированы с помощью нескольких методов, в том числе иммунофенотипирования, сортировки клеток, изображений, иммуноблотинга, экспрессии мРНК, клеточной культуры, и в пробирке функциональных анализов, таких как смешанные реакции лейкоцитов, пролиферации, или цитотоксичности.

Рассечение тканей мышиных из интерфейса материнской плода показано на рисунке 1; эта процедура включает в себя открытие в брюшную полость (рис 1а, б), рога матки (рис 1в) в том числе мест имплантации (рис 1D) и сбор маточных тканей (рис 1E), плацент?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Выделение Брейн-Лейкоциты проникают

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

РНК Выделение Синегнойной палочки Колонизация мышей Желудочно-кишечный тракт

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-инфицированных мышей

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Биоэнергетика и окислительного: протоколах выделения и оценки человека лейкоцитов и тромбоцитов

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Выделение моноцитов человека, дважды градиентного центрифугирования и их дифференциации с макрофагами в тефлоновым покрытием культуре клеток Сумки

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Выделение и Трансплантация различных престарелых мышиных тимуса трансплантатов.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...