Name: spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks
Uploaded: 2015-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Brent Harris for at levere kritisk gennemgang af manuskriptet. Disse undersøgelser blev foretaget på Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopathology &amp; Tissue Delt ressource, som er delvist understøttet af NIH / NCI tilskud P30-CA051008. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Cancer Institute eller National Institutes of Health.

1. Konstruktion af stedet <ol><li> Der tilsættes 50 mg bovint serumalbumin (BSA) til 1 ml væv mærkning farvestof i en 15 ml konisk rør eller 2 ml mikrofugerør og vortex i 1 min eller indtil den er helt opløst. Bemærk: Til denne protokol, anvender biokemiske Grade BSA. Mens andre kvaliteter og renheder ikke er blevet testet, forventes det, at lønklasse og renhed ikke ville have en betydelig indvirkning på succesen med stedet. </li><li> Heat 9 ml hydroxyethyl agarose forarbejdning gel i en 15 ml konisk r...

<ol>
	<li>Jawhar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+rapidly+evolving+diagnostic+and+research+tool.">Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool.</a> Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).</li><li>Dhir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+an+overview.">Tissue microarrays: an overview.</a> Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).</li><li>Saxena, R., Bade, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7+Tissue+Microarray+–+Construction+and+Quality+Assurance.">Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance.</a> Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , (2013).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).</li><li>Rangel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+microarray:+helpful+hints.">The tissue microarray: helpful hints.</a> J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).</li><li>Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+immunophenotyping+of+43+ferret+lymphomas+using+tissue+microarray+technology.">High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology.</a> Vet. Path. 44, 196-203 (2007).</li><li>Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+one+size+does+not+fit+all.">Tissue microarrays: one size does not fit all.</a> Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).</li><li>Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray-based+immunohistochemical+study+can+significantly+underestimate+the+expression+of+HER2+and+progesterone+receptor+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.">Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).</li><li>Wampfler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+numbers+of+cores+based+on+tissue+microarray+antibody+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer.">Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer.</a> J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).</li><li>Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+players+in+hepatocarcinogenesis:+Limits+and+opportunities+of+using+tissue+microarray+(TMA).">Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA).</a> Microarray. 3, 91-102 (2014).</li><li>Miettinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+multitissue+blocks+without+special+equipment.">A simple method for generating multitissue blocks without special equipment.</a> Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li><li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing.">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li><li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).</li><li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft&#8217;s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).</li></ol>

Vellykket forberedelse og udnyttelse af pletterne kræver omhyggelig overholdelse af nogle tekniske trin. Smeltning af hydroxyethyl agarose bør ske langsomt og ved lav varme. Melting hurtigt ved høj varme kan resultere i en vis nedbrydning af agarose i mindre end optimale resultater. Når skære dye-laden stik i stykker for behandling, sikre, at tykkelsen af ​​hvert stykke er større end 4,5 mm, og ikke overstiger 7 mm. De afrundede ender fjernes som affald, da de ikke er ensartet 5 mm i tykkelse. Pieces mindre en...

Evnen til at integrere vævsprøver fra flere individer i en enkelt paraffin blok gør det nemt side-by-side sammenligning mellem behandlinger og enkeltpersoner, fjerner variabilitet mellem dias, og reducerer omkostningerne og arbejdsbyrden for sektionering og farvning prøver. Disse multi-vævsblokke fremstilles typisk som enten væv microarrays (TMA) eller paraffinblokke indeholder væv fra flere individer i en ikke-matrix layout. Vedligeholdelse af prøve identitet er afgørende for succes for enhver multi-væv analyse. Forskere har brugt TMAs siden deres udvikling for at forbedre effektiviteten af analyser, reducere variation mellem dias, bevare værdifulde ressourcer væv og reducere den tid og omkostninger til eksperimenter 1. Korrekte orientering af TMAs kan tilvejebringes ved anvendelse af en række fremgangsmåder, herunder mellemrum, rækker eller kolonner mellem vævskerner 2-4, asymmetrisk arrangement af kernegrupper 3, 5 (f.eks control vs. behandling), &quot;beacon&quot; kerner 6 og udpegede orientering kerner placeret uden for TMA matricen 3. Selv om disse metoder fungerer godt for TMAs, de fleste forbruger værdifulde TMA core plads og TMAs med huller og mellemrum som identifikatorer kan blive forvirrende, da væv kerner er opbrugt over tid. Derudover disse metoder er ikke egnede til brug i multi-væv blokke uden et array format, fordi de er afhængige af uregelmæssigheder i den stramt bestilt mønster af ensartede microarray kerner som identifikatorer. De fleste ikke-klædt multi-væv blokke skal rumme ikke-ensartede væv og per definition ikke vise den strukturerede vifte gitter, der gør disse afvigelser skiller sig ud som vartegn. Selvom der er mange fordele ved at bruge en TMA, en af de største ulemper er den lille størrelse af kernerne, som ikke altid er repræsentative for stort set heterogen væv 1. Ikke-opstillede multi-væv blokke giver mange af than nyder en TMA, men indeholder større vævsprøver eller hele organer fra dyreforsøg. Tissue microarrays bruger enkelte kerner har varierende overensstemmelse med hele vævssnit baseret på proteinet af interesse, og mange kræver flere kerner til øget overensstemmelse 7-11. På grund af kompleksiteten og heterogene karakter af nogle biomarkør fænotyper, TMAs hjælp selv store antal kerner (&gt; 10) kan stadig være utilstrækkelig og kan kræve andre end microarrays til analyse 8 metoder. Derudover TMA konstruktion er tidskrævende, teknisk krævende, og kræver den oprindelige pris og investering i eller adgang til et væv arrayer. Ikke-grupperede multi-væv blokke kan foretages i enhver grundlæggende laboratorium med betydeligt mindre tid og kræfter og er et gyldigt alternativ til undersøgelser, der kræver mere væv end arrays tillade eller som et middel til at reducere omkostningerne og forenkle analysen. Ikke-klædt multi-væv blokke på samme måde kræve en pålidelig ellerientation markør til at spore prøveidentifikation imidlertid udviklingen af ​​disse markører er blevet begrænset. Meget af den litteratur, der beskriver væv orientering fokuserer på korrekt fysiologisk orientering for indlejring individuelle vævsstykker, såsom tatovering vævet med blæk 12, præ-embedding væv i agar-gelatine inden forarbejdningen 13, og mærkning bestemte væv med indskæringer 14 eller suturer 15 . Selv om funktionelle, disse metoder er ikke ideelle som markører i multi-vævsblokke på grund af deres begrænsninger. En sutur vil blive sektioneret igennem hurtigt og kan ikke ses i hver sektion. Pre-embedding teknikker, der anvender agar-gelatine kan holde vævet i korrekt orientering under bearbejdning og forankring, men giver ikke en visuel cue til at skelne mellem flere prøver i paraffin blok og dias. Indhak eller farvestof på væv kan komplicere analyse eller okkludere vigtige morfologiske detaljer. Alternativt væv identiteti en ikke-klædt multi-vævsblok kan opretholdes ved indlejring af vævsstykker i et asymmetrisk arrangement, men det kræver 3 eller flere vævsstykker og kan ikke tillader optimal indretning af væv til analyse. Den Prøve Orientering Tag (spot) er udviklet som en nem og billig metode til klart at identificere væv i multi-væv blokke og byder på mange fordele i forhold til eksisterende orientering metoder. Stedet er et lille, farverig, kerne bestående af Hydroxyethyl agarose behandling gel og væv mærkning farvestof, og infiltreret med paraffin (figur 2C). SPOT kerne er integreret på enden ved siden af en enkelt væv i en multi-væv paraffin blok og fremstår som en farvestrålende prik i blokken og i hvert afsnit (figur 1A - D) med tydelig angivelse af korrekt orientering af blokken og sektioner for nem identifikation væv.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Multi-væv paraffinblokke giver high throughput analyse med øget effektivitet, eksperimenterende ensartethed og reduceret tid og omkostninger. Tissue microarrays udgør størstedelen af ​​multi-væv paraffinblokke, men i stigende grad er forskere ved hjælp af ikke-klædt blokke med større væv fra flere individer, der kan give mange af fordelene ved væv microarrays uden betydelige investeringer i planlægning og udstyr. En kritisk komponent i enhver multi-væv analyse er orienteringen metode, der anvendes til at identificere de enkelte væv. Selv om der findes metoder til at opretholde en korrekt orientering og identifikation af væv i multi-vævsblokke, de fleste er ikke velegnede til ikke-klædt blokke kan forbruge værdifuld plads i en matrix og / eller er vanskelige at fremstille i standard histologi laboratorium. Den Prøve Orientering Tag (spot) er en enkel, billig orientering værktøj, der er klart synlig i paraffinblokke og alle vævssnit for pålidelig model identifikation i grupperede og ikke-grupperede layouts. SPOT giver fordele i forhold til eksisterende orientering metoder til ikke-klædt blokke, da det ikke kræver nogen direkte ændring af væv og giver mulighed for fleksibilitet i indretning af væv stykker.

SPOT vises som en rund, farvestrålende prik i paraffin blok (figur 1A og 2D), i alle paraffinsnit, og forbliver på glasset glide gennem H &amp; E eller IHC farvningsprocedure (figur 1B - 1D og 2D). Denne åbenlyse visuelle cue hjælpemidler både den histotechnician og forsker i at identificere de enkelte væv stykke og forenkler kommunikation som histotechnician kan bruge denne visuelle cue til at angive placeringen af ​​vævssty...

Watch this Scientific Journal Video about SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks at JoVE.com

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Formålet med Specimen Orientation Tag (spot) er at fungere som en orientering værktøj til at hjælpe med individuelle væv identifikation i flere væv paraffinblokke. Disse protokoller viser, hvordan det er konstrueret let fra almindelige, billige histologi materialer og fungerer som en pålidelig visuel markør i paraffinblokke og sektioner.

Spot den korrekte Tissue hver gang i Multi-væv Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulere Murine tårekirtlen

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Dissektion af Auditory Bulla i postnatale mus: Isolering af mellemøret Knogler og Histologisk analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-klar: En væv Clearing metode til tredimensional billeddannelse af fedtvæv

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Light spot-baseret assay til analyse af Drosophila larval phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...