Name: spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks
Uploaded: 2015-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Dr. Brent Harris for å gi kritisk gjennomgang av manuskriptet. Disse undersøkelsene ble gjennomført på Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopatologi &amp; Tissue delt ressurs som er støttet delvis av NIH / NCI tilskuddet P30-CA051008. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Cancer Institute eller National Institutes of Health.

1. Bygging av The Spot <ol><li> Tilsett 50 mg bovint serumalbumin (BSA) til en vev ml markeringsfarvestoff i et 15 ml konisk rør eller 2 ml mikrosentrifugerør og virvle i 1 min eller inntil fullstendig oppløst. Merk: For denne protokollen, bruker biokjemiske Grade BSA. Mens andre karakterer og renhet ikke er testet, er det forventet at klasse og renhet ikke ville ha en betydelig innvirkning på suksessen til stedet. </li><li> Varme 9 ml hydroksyetyl ​​agarose-gel prosessering i et 15 ml konisk rør i en ...

<ol>
	<li>Jawhar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+rapidly+evolving+diagnostic+and+research+tool.">Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool.</a> Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).</li><li>Dhir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+an+overview.">Tissue microarrays: an overview.</a> Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).</li><li>Saxena, R., Bade, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7+Tissue+Microarray+–+Construction+and+Quality+Assurance.">Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance.</a> Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , (2013).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).</li><li>Rangel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+microarray:+helpful+hints.">The tissue microarray: helpful hints.</a> J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).</li><li>Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+immunophenotyping+of+43+ferret+lymphomas+using+tissue+microarray+technology.">High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology.</a> Vet. Path. 44, 196-203 (2007).</li><li>Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+one+size+does+not+fit+all.">Tissue microarrays: one size does not fit all.</a> Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).</li><li>Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray-based+immunohistochemical+study+can+significantly+underestimate+the+expression+of+HER2+and+progesterone+receptor+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.">Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).</li><li>Wampfler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+numbers+of+cores+based+on+tissue+microarray+antibody+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer.">Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer.</a> J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).</li><li>Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+players+in+hepatocarcinogenesis:+Limits+and+opportunities+of+using+tissue+microarray+(TMA).">Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA).</a> Microarray. 3, 91-102 (2014).</li><li>Miettinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+multitissue+blocks+without+special+equipment.">A simple method for generating multitissue blocks without special equipment.</a> Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li><li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing.">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li><li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).</li><li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft&#8217;s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).</li></ol>

Vellykket utarbeidelse og utnyttelse av stedene krever nøye overholdelse av noen tekniske trinn. Smelting av hydroksyetyl ​​agarose bør gjøres langsomt og ved lav varme. Som smelter raskt ved høy varme kan resultere i noen nedbryting av agarose til mindre enn optimale resultater. Når du kutter de fargestoff laden plugger i stykker for behandling, sikre at tykkelsen på hver brikke er større enn 4,5 mm og ikke overstiger 7 mm. De avrundede ender fjernes som avfall som de ikke er jevnt 5 mm i tykkelse. Stykker m...

Muligheten til å legge inn vevsprøver fra flere personer i en enkelt parafinblokken muliggjør enkel side-by-side-sammenligning mellom behandlingene og enkeltpersoner, eliminerer variasjon mellom lysbilder, og reduserer kostnadene og arbeidsmengden seksjonering og flekker prøver. Disse fler vevsblokker fremstilles typisk som enten microarray (TMA) eller parafinblokker inneholdende vev fra flere individer i en ikke-matrise layout. Vedlikehold av prøven identitet er avgjørende for å lykkes i enhver multi-vev analyse. Forskere har brukt TMA siden deres utvikling for å forbedre effektiviteten i analysen, redusere variasjon mellom lysbilder, spare verdifulle vev ressurser og redusere tid og kostnader for eksperimenter en. Riktig orientering av TMA kan oppnås ved hjelp av en rekke metoder, inkludert tomme områder, rader eller kolonner mellom vev kjerner 2-4, asymmetrisk arrangement av kjernegruppene 3, 5 (f.eks kontrol vs. behandling), &quot;beacon&quot; kjerner 6, og utpekte orientering kjerner som ligger utenfor TMA matrix 3. Selv om disse metodene fungerer godt for TMA, mest forbruke verdifull TMA kjerneområder og TMA med hull og mellomrom som identifikatorer kan bli forvirrende som vev kjerner er utslitt over tid. I tillegg er disse metodene er ikke egnet for bruk i fler vevsblokker uten en rekke format fordi de er avhengige av anomalier i tett organisert mønster av ensartede microarray kjerner som identifikatorer. De fleste ikke-kledd multi-vevsblokker må imøtekomme uensartede vev og per definisjon, ikke vis strukturert rekke rutenett som gjør at disse avvikene skiller seg ut som landemerker. Selv om det er mange fordeler med å bruke en TMA, en av de største ulempene er den lille størrelsen på kjernene som ikke alltid er representativ for i hovedsak heterogent vev 1. Ikke-kledd multi-vevsblokker gi mange av tHan drar av en TMA, men inneholder større vevsprøver, eller hele organer fra dyrestudier. Microarray for ved hjelp av enkle kjerner har varierende samsvar med hele vevssnitt basert på protein av interesse og mange krever flere kjerner for økt samsvar 7-11. På grunn av kompleksiteten og heterogene natur noen biomarkør fenotyper, ved bruk av TMA og med et stort antall kjerner (&gt; 10) fortsatt kan være utilstrekkelig og kan kreve andre enn mikromatriser for analyse 8 metoder. I tillegg er TMA bygging tidkrevende, teknisk krevende, og krever den opprinnelige prisen og investering i eller tilgang til en vev arrayer. Ikke-oppstilt fler vevsblokker kan gjøres i en hvilken som helst grunnleggende laboratorie med betydelig mindre tid og arbeid, og er en gyldig alternativ for undersøkelser som krever mer enn arrays tillate vev eller som et middel for å redusere kostnader og forenkle analysen. Ikke-kledd multi-vevsblokker samme måte krever en pålitelig ellerientation markør for å spore prøven identifikasjon, men utviklingen av disse markørene har vært begrenset. Mye av litteraturen som beskriver vev orientering fokuserer på riktig fysiologisk orientering for innebygging enkelte vev stykker, for eksempel tatovering vevet med blekk 12, pre-embedding vev i agar-gelatin før prosessering 13 og merking visse vev med hakk 14 eller sting 15 . Selv om funksjonell disse metodene er ikke egner seg som markører på fler vevsblokker grunn av deres begrensninger. En sutur vil bli seksjonert gjennom raskt og kan ikke være synlig i hver seksjon. Pre-innebygging teknikker ved hjelp av agar-gelatin kan holde vevet i riktig orientering under bearbeidelse og innstøping, men gir ikke en visuell indikator for å skille mellom flere prøver i parafin blokken og lysbilder. Hakk eller fargestoff på vev kan komplisere analysen eller tilstoppe viktige morfologiske detaljer. Alternativt, vev identiteti en ikke-kledd flere vevsblokk kan opprettholdes ved innstøping av vev stykker i et asymmetrisk arrangement, men dette krever tre eller flere vev stykker og kan ikke gi rom for en optimal anordning av vev for analyse. Den prøveorientering Tag (spot) er utviklet som en enkel og billig metode for å identifisere vev på fler vevsblokker og tilbyr mange fordeler over eksisterende orienterings metoder. Stedet er en liten, fargerik, kjernen består av Hydroksyetyl ​​agarose behandling gel og vev merking fargestoff, og infiltrert med parafin (figur 2C). Spot kjernen er innebygd på slutten ved siden av en enkelt vev i en multi-vev parafin blokk og fremstår som en fargerike prikk i blokken og i hver seksjon (Figur 1A - D), som klart viser riktig retning av blokken og seksjoner for enkel vev identifikasjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Multi-vev parafinblokker gir høy gjennomstrømning analyse med økt effektivitet, eksperimentell ensartethet, og redusert tid og kostnader. Microarray utgjør flertallet av multi-vev parafinblokker, men i økende grad, er forskere med ikke-kledd blokker som inneholder større vev fra flere personer som kan gi mange av fordelene med microarray uten betydelige investeringer i planlegging og utstyr. En kritisk komponent i en fler vev analyse er orienteringen metoden som brukes for å identifisere hver enkelt vev. Selv om metoder finnes for å opprettholde riktig orientering og identifisering av vev på fler vevsblokker, de fleste er ikke godt egnet til ikke-kledd blokker, kan forbruke verdifull plass i en matrise og / eller er vanskelig å produsere i standard histologi laboratorium. Den prøveorientering Tag (spot) er en enkel, rimelig orientering verktøy som er godt synlig i parafinblokker og alle vevsdelene for pålitelig prøven identifikasjon i kledd og ikke-kledd oppsett. Spot gir fordeler i forhold til eksisterende orienterings metoder for ikke-kledd blokker som det ikke krever noen direkte endring i vevet og gir rom for fleksibilitet i ordningen av vev stykker.

Spot vises som en runde, fargerike prikk i parafinblokken (Figur 1A og 2D), i alle parafinsnitt, og er fortsatt på glasset skyv gjennom H &amp; E eller IHC farging prosedyre (Tall 1B - 1D og 2D). Denne åpenbare visuelle cue hjelpemidler både den histotechnician og forsker i å identifisere hver enkelt vevstykke og forenkler kommunikasjon som histotechnician kan bruke denne visuelt å indikere arrangementet av vev stykker til forskere...

Watch this Scientific Journal Video about SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks at JoVE.com

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Formålet med prøveorientering Tag (spot) er å fungere som en orientering verktøy til hjelp i enkelte vev identifikasjon i multi-vev parafinblokker. Disse protokollene demonstrere hvordan den er konstruert lett fra vanlige og lave kostnader histologiske materialer og fungerer som en pålitelig visuell markør i parafinblokker og seksjoner.

Spot Riktig Tissue hver gang i Multi-vevsblokker

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulere Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Disseksjon av det auditive Bulla i barsel Mus: Isolering av mellomøret Bein og histologisk analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Lett spot-basert analyse for analyse av Drosophila larvestadiet Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...