Name: implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms at JoVE.com

The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. De beoordeling van GI 50 voor verbinding (en) van belang <ol><li> Genereer growth curve (s) cellijnen van belang de juiste zaaidichtheid beoordelen. Plot het aantal cellen op verschillende tijdstippen na het zaaien (dagen 2, 4, 6 en 8) ten opzichte van dag 0. Dit zal een relatieve groeisnelheid van de cellijn interessegebied en worden gebruikt om de initiële zaaidichtheid zodat beoordelen samenloop is niet in 96-wells platen binnen 7 dagen bereikt. </li><li> Zodra groeicurven zijn bepaald, zaad geschikte aantal cellen in niet-transparante, heldere bodem 96-putjesplaten in 100 pl celmedium GI 50 beoordelen. Zaad het aantal cellen op basis van de gebruikte cellijn en bepaald op 1,1. Typisch, zaad 3x10 3 cellen voor snel groeiende cellijnen met een verdubbeling tijd van ~ 24 uur, bijv., HCT116. <ol><li> Bereid een testplaat (dag 1). Voor de assay plaat, zaad cellen op de gewenste dichtheid in 100 ul van cultuur media in putten schaduw in het blauw (figuur 1). Wells wit gemarkeerd bevatten slechts media. </li><li> Bereid een controle plaat (dag-1). Voor de controle plaat zaad dezelfde dichtheid van cellen als in stap 1.2.1 in 100 ui kweekmedium in een afzonderlijke 96-wells plaat. Deze &#39;dag 0&#39; lezen zal helpen bij het ​​interpreteren van de cytostatische / cytotoxische aard van de verbindingen geanalyseerd (Figuur 2). </li></ol></li><li> De volgende dag (dag 0), lees de controle plaat. Equilibreren luminescente cellevensvatbaarheid reagens (CellTiter-Glo substraat gemengd met buffer volgens de instructies van de fabrikant) tot KT en meng voorzichtig door het omkeren van inhoud om een ​​homogene oplossing te verkrijgen. Voeg 80 ul reagens aan de 100 ui cellen / media mix en schud inhoud gedurende 30 min om cellysis te induceren. <ol><li> Record luminescentie met een lichtmeter ingesteld op een blootstelling van 0,1-1,0 sec en detectie golflengte van 560 nm. </li></ol></li><li> Voeg proefverbindingen (verbindingenplaats) platen (dag 0) testen. Maak een 1: 4 seriële verdunning van verbindingen in DMSO bij 200x eindconcentratie in totaal 10 concentraties (9 verdunningen verbinding en slechts één DMSO, verbinding plate). Als een eerste uitgangspunt, streven naar een 200x laagste dosis van 0,03 pm en een top dosis van 2000 uM (uiteindelijk volume van 200 pi). </li><li> Voeg serieel verdund verbindingen medium om een ​​verbinding-medium mix 10x uiteindelijke concentratie (uiteindelijk volume van 100 pi, tussenplaat) te maken. Bewaar de samengestelde plaat bij -20 ° C voor gebruik op dag 3 van de assay. Voeg 10 ul van verbinding- mengeling middel aan cellen in drievoud zodanig dat de hoogste dosis 10 uM (bv., Rijen B, C en D, dag 0) (Figuur 1). Incubeer assay platen gedurende 3 dagen bij 37 ° C. Gooi tussenplaat (s) na gebruik. </li><li> Op dag 3, stelt een 400 pl 1x verbinding- mengeling middel toepassing van de verbinding bereid in platen 1,4. Omkeren assay platen om media te verwijderen en dep droog op autoclaved papieren handdoeken 2-3x om de resterende media te verwijderen. Voeg verbinding / media (100 gl / putje) aan putjes gearceerd blauw en voeg 100 pl media perimeter putten verdamping (figuur 1) te voorkomen. Opnieuw incubeer de assay platen bij 37 ° C gedurende nog 3 dagen. </li><li> Op dag 6, beoordeelt relatief aantal levensvatbare cellen door het uitvoeren van een luminescentie lezing beschreven in stap 1,3. </li><li> Gebruik de dag 0 lezen om de statische / toxische aard van verbindingen te beoordelen. Giftige stoffen apoptose terwijl cytostatica induceren celcyclus. Als verbinding is toxisch (dag 6 lezen is hieronder dag 0 lezing), overwegen het kiezen van GI 50 en GI 50 x 5 concentraties voor resistentie assays. Indien de verbinding induceert stasis (gelijk aan of hoger dan d0 lezing) overwegen GI 100 en 100 GI x5 voor resistentie assays (figuur 2). </li></ol> 2. Het opzetten van Drug Resistance Testen <ol><li> Als het werken witha cytostaticum, zaad cellen bij een confluentie van 30-40% in 150 mm 2 weefselkweekschalen (volume = 30 ml) voor de resistentietest. Bij het werken met een giftige stof, zaad op een 70-80% samenvloeiing. </li><li> Voor cellijnen die een intacte mismatch repair (MMR) mechanisme haven, incubeer cellen van stap 2,1 O / N bij 37 ° C met het carcinogeen N-ethyl-N-nitrosourea (ENU). Behandel de cellen met 30 pi van een voorraadoplossing van 50 mg / ml ENU (eindconcentratie 50 gg / ml) tot genomische instabiliteit verbeteren. Voor cellijnen die defect MMR (tabellen 2 en 3) is behandeling met ENU of andere kankerverwekkende stoffen niet nodig zijn. <ol><li> Voor andere cellijnen bepalen MMR-deficiëntie door NCI criteria behulp van microsatelliet instabiliteit 12, of gebaseerd op de gepubliceerde karakterisering met behulp van microsatelliet instabiliteit testen of genome / epigenomisch profilering van MMR genen 13-15. </li></ol></li><li> Behandel de cellen met de testverbinding (en)belang bij de concentratie bepaald in stap 1.8. Voor zeer toxische verbindingen die celdood in een typische driedaagse levensvatbaarheid assay 10 veroorzaken, te beginnen met een lage dosis behandeling (dwz GI 50) en stapsgewijs verhogen van de concentratie (veelvouden van GI 50) verbinding elke 2-3 weken tot robuust resistentie waargenomen. Vul media en verergeren elke 3 d. </li><li> Zodra de selectie is geïnitieerd, verandering media / samengestelde mix om de 3-4 dagen tot resistente klonen ontstaan. Weerstand per definitie ontstaat wanneer behandelde cellen vertonen grotere groei / levensvatbaarheid tijdens behandeling met geneesmiddelen ten opzichte van acute behandeling van met DMSO behandelde controlecellen. </li></ol> 3. Het isoleren van Single Cell Clones <ol><li> Onderzoek cultuur schotel met behulp van fase-contrast microscopie (vergroting 40x) voor levensvatbare clusters van cellen. </li><li> Mark bevredigend klonen onderaan de schaal met een markeerstift. Pick-klonen die zijn van gemiddelde grootte (grotere kolonies kanafkomstig uit meerdere cellen) en goed geïsoleerd van andere kolonies. Pick-klonen met behulp van een van de twee benaderingen beschreven in stap 3.3. </li><li> Benadering 1: Met een Pipettor (figuur 3) <ol><li> Verwijder de groei media en spoel met 1x PBS om een ​​drijvend cellen te verwijderen. </li><li> Gebruik zwarte vlekken als gids voor &#39;picking&#39; klonen met pipet tip (verbonden aan pipet, bij voorkeur P200). </li><li> Transfer klonen in 48-well platen met 200 ul vers medium (met een half verbinding concentratie optimaal herstel van de cellen mogelijk te maken). </li><li> Laat cellen om te herstellen voor 2-3 dagen voor het toevoegen van 200 ul vers medium / ideale concentratie verbinding. </li><li> Blijven media / verbinding te veranderen om de 3-4 dagen en blijven klonen uit te breiden. </li></ol></li><li> Benadering 2: Gebruik Cloning Schijven (figuur 3) <ol><li> Markeer klonen zoals beschreven in stap 3.2. </li><li> Plaats 3 mm klonen schijven in een 10 cm weefselkweek schaal bevattende 5 ml 0,25% trypsin-EDTA gedurende 2 min. </li><li> Zuig media uit schotel met resistente klonen en overlay klonen met trypsine gedrenkt klonen schijven met behulp van steriele pincet. </li><li> Laat gedurende 1-2 minuten, afhankelijk van het gemak waarmee klonen tillen van de platen, in een 37 ° C incubator. </li><li> Neem kloneren discs met steriele pincet en zetten in 48-well platen met 200 ul vers medium en de halve concentratie van de verbinding. </li><li> Pipet zachtjes op en neer om de cellen los te maken van klonen schijven en geïncubeerd O / N bij 37 ° C (reactie klonen discs in putjes). </li><li> De volgende ochtend, verwijder het klonen van schijven van 48-well platen en putten te vullen met 200 ul vers medium / verbinding (half ideale concentratie verbinding). </li><li> Drie dagen later, vullen medium met het ideale concentratie van de verbinding. </li><li> Blijven de media / verbinding te veranderen om de 3-4 dagen en blijven klonen uit te breiden. </li></ol></li></ol> 4. Het beoordelen van Mate van Rslijst van geïsoleerde klonen <ol><li> Zodra 20/10 kolonies worden geëxpandeerd, genereren GI 50 curves zoals beschreven in stap 1 om de mate van resistentie beoordelen. </li><li> Omvatten altijd controle populatie behandeld met DMSO tijdens het selectieproces. Het is zeer waarschijnlijk dat het spectrum van resistentie zal groot zijn (wat blijkt gedeeltelijke terwijl anderen blijkt volledige resistentie). Verzamel een paar klonen uit elk van deze klassen als resistentiemechanisme kan variëren tussen de twee groepen. </li></ol> 5. Next-generation sequencing <ol><li> Spin down 2 miljoen cellen (controle en resistente klonen) (500 xg gedurende 5 minuten) in 15 ml conische buisjes zowel gDNA en RNA verzameling (dus 2 x 2.000.000). </li><li> Twee keer wassen met 1x PBS en pellets in de -80 ° C te bevriezen totdat klaar voor isolatie. </li><li> Gebruik commerciële extractie kit RNA of gDNA isolaat volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Monsters voor next-generation sequencing indienenmet behulp van het protocol leverancier 10. </li></ol> 6. Bioinformatica analyse van monsters (whole-exome sequencing) <ol><li> Preprocess sequence data volgens een best practice DNA-seq pijplijn 16. <ol><li> Alles leest om te verwijzen naar het menselijk genoom GRCh37 met BWA 17. Omzetten ongecomprimeerde SAM geformatteerd rooilijnen van gecomprimeerde BAM formaat met Samtools 18. Sorteren afstemmingen door te coördineren met Samtools. Voeg lees- groepen met Picard. (Voor specifieke BWA, Samtools en Picard commando&#39;s, zie aanvullende tekst 1, regels 1-4) </li><li> Markeer alle duplicaten leest met behulp van de MarkDuplicates opdracht van de Picard tool set 19. Index dit bestand met Samtools. (Aanvullende tekst 1, regels 5-6) </li><li> Om mismatched bases te minimaliseren in alle leest, uitlijnen leest lokaal op gebieden herbergen kleine toevoegingen of weglatingen met behulp van een indel realigner 20. (Aanvullende tekst 1, regels 7-8) </li><li> Verdere verbetering van de accuracy van variant roeping, empirisch Recalibrate base kwaliteit scoort met behulp van een basis kwaliteitsscore herijking tool. De basis kwaliteit kalibratie hulpmiddel moet niet alleen de juiste initiële kwaliteit score, maar ook rekening houden met covariatie van verschillende functies, zoals te lezen groep machine cyclus, base positie en dinucleotide context (vorige + huidige basen). Genereer recalibrated BAM met Picard PrintReads. (Voor specifieke commando&#39;s voor deze stap, zie aanvullende tekst 1, regels 9-10) </li><li> Herhaal de stappen 6.1.1 tot 6.1.4 (aanvullende tekst 1, regels 1-10) voor elk monster gesequenced. </li></ol></li><li> Identificeren single nucleotide variatie (SNV) in elke kloon met behulp van een gekoppeld variant bellen tool19, 21-23. Voor elke kloon gesequenced, lopen gepaarde variant bellen met behulp van de ouderlijke kloon als geëvenaard &quot;normaal&quot;. (Aanvullende tekst 1, lijn 11) </li><li> Filter terugkerende, hoogwaardige varianten en voor te bereiden op annotatie met een variant annotatie gereedschap 24. Deprioritize variants niet voor alle resistente klonen. (Zie R script in aanvullende text 2) </li><li> Annoteren varianten met een annotatie hulpmiddel 25, 26. Veel variant annotatiehulpmiddelen hebben een begeleidende web app zodat gegevens kunnen worden geüpload en verwerkt door een externe server. </li><li> Gebruik een functionele gevolgen voorspelling hulpmiddel 27-29 aan die varianten voorspeld van het hebben van een hoge functionele gevolgen prioriteren. Net als variant annotatie, verschillende tools beschikbaar zijn voor functionele gevolgen voorspellen via een webinterface. </li></ol>

<ol>
	<li>Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blueprint+for+advancing+genetics-based+cancer+therapy.">A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy.</a> Cell. 147 (1), 26-31 (2011).</li><li>Housman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+in+cancer:+an+overview.">Drug resistance in cancer: an overview.</a> Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).</li><li>Balbas, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+mutation-based+resistance+to+antiandrogens+with+rational+drug+design.">Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design.</a> Elife. 2, e00499 (2013).</li><li>Joseph, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+androgen+receptor+mutation+confers+resistance+to+second-generation+antiandrogens+enzalutamide+and+ARN-509.">A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509.</a> Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).</li><li>Korpal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+F876L+mutation+in+androgen+receptor+confers+genetic+and+phenotypic+resistance+to+MDV3100+(enzalutamide).">An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide).</a> Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li><li>Whittaker, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNA+interference+screen+implicates+NF1+loss+in+resistance+to+RAF+inhibition.">A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition.</a> Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).</li><li>Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptome+sequencing+to+identify+mechanisms+of+drug+action+and+resistance.">Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance.</a> Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).</li><li>Adams, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+Is+the+Cellular+Target+of+STF-31-Like+Small-Molecule+Probes.">NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).</li><li>Bhang, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+clonal+dynamics+in+response+to+cancer+therapy+using+high-complexity+barcoding.">Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding.</a> Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).</li><li>Boland, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+National+Cancer+Institute+Workshop+on+Microsatellite+Instability+for+cancer+detection+and+familial+predisposition:+development+of+international+criteria+for+the+determination+of+microsatellite+instability+in+colorectal+cancer.">A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).</li><li>Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+instability+in+colorectal+adenocarcinoma+cell+lines+that+have+full-length+adenomatous+polyposis+coli+protein.">Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein.</a> Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).</li><li>Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+extent+of+microsatellite+instability+in+human+cell+lines+with+defects+in+different+mismatch+repair+genes.">Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes.</a> Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).</li><li>Ahmed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+and+genetic+features+of+24+colon+cancer+cell+lines.">Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines.</a> Oncogenesis. 2, e71 (2013).</li><li>. GATK Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/gatk/guide">https://www.broadinstitute.org/gatk/guide</a> (2015)</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).</li><li>Cibulskis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+somatic+point+mutations+in+impure+and+heterogeneous+cancer+samples.">Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).</li><li>Larson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SomaticSniper:+identification+of+somatic+point+mutations+in+whole+genome+sequencing+data.">SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VarScan+2:+somatic+mutation+and+copy+number+alteration+discovery+in+cancer+by+exome+sequencing.">VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing.</a> Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).</li><li>. Oncotator Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/oncotator">https://www.broadinstitute.org/oncotator</a> (2015)</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), e164 (2010).</li><li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms,+SnpEff:+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118;+iso-2;+iso-3.">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly. 6 (2), 80-92 (2012).</li><li>Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+functional+impact+of+protein+mutations:+application+to+cancer+genomics.">Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li><li>Ng, P. C., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIFT:+Predicting+amino+acid+changes+that+affect+protein+function.">SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).</li><li>Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effect+of+human+missense+mutations+using+PolyPhen-2.">Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2.</a> Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Abaan, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exomes+of+the+NCI-60+panel:+a+genomic+resource+for+cancer+biology+and+systems+pharmacology.">The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology.</a> Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).</li><li>Forbes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmic+2005.">Cosmic 2005.</a> Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).</li><li>Shah, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+and+mutational+evolution+spectrum+of+primary+triple-negative+breast+cancers.">The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers.</a> Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+PTPRB+and+PLCG1+mutations+in+angiosarcoma.">Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).</li><li>de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DNA+mismatch+repair:+effects+on+the+rate+of+mutation+to+drug+resistance.">Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance.</a> J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).</li><li>Kotani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+miR-128b+gene+reduces+miRNA+processing+and+leads+to+glucocorticoid+resistance+of+MLL-AF4+acute+lymphocytic+leukemia+cells.">A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).</li><li>Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stroma-mediated+resistance+to+FLT3+inhibitors+in+FLT3-ITD+AML+is+mediated+by+persistent+activation+of+extracellular+regulated+kinase.">Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase.</a> Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).</li><li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade.">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li><li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li></ol>

Publicatie kosten voor dit artikel worden betaald door H3 biogeneeskunde.

Selectie van cellijn (s): karakterisatie van genetische staat en genomische instabiliteit Ongetwijfeld is de belangrijkste factor in het succesvol blootleggen van klinisch relevante resistentie mechanismen is de eerste cellijn selectie. Twee factoren moeten worden overwogen. Ten eerste beogen cellijn (s) van hetzelfde geslacht / subtype herbergt het bepalen van genetische kenmerken van de ziekte te selecteren (bv., BRAF V600E bij melanomen). Afvragen van publiekelijk beschikbare transcriptoom en mutatiegegevens beide cellijnen en primaire 30-32 / metastase tumoren voor verschillende indicaties 33,34 wordt de selectie te vergemakkelijken. Hoewel de identificatie van cellijnen met klinisch relevante genetische veranderingen is ideaal, in sommige gevallen kan dit niet mogelijk wegens gebrek aan beschikbare cellijnen of haalbaar door factoren zoals moeilijkheden en lengte van de screening. <p class="jove_content"&gt; Met betrekking tot de eerder genoemde punt, een tweede factor om overweeg dan tijdens cellijn selectie is het gemak of de haalbaarheid van verzet screenen met behulp van de gewenste lijn. Zo kunnen factoren zoals proliferatie en intrinsieke mutatie grote invloed op de snelheid van de ontdekking. Daartoe kunnen cellijnen worden gebruikt met snellere groei kinetiek en deficiënt DNA MMR mechanismen in de hoop dat ontstaan ​​van spontane resistentie kan worden versneld 35. Op basis van de COSMIC database meerdere kandidaat cellijnen bestaan ​​deficiëntie op twee frequent gemuteerde MMR-genen, MSH2 en MLH1 (tabellen 2 en 3). Als alternatief, als cellijnen plaats niet bestaan ​​lagerdefecten in MMR, acute behandeling met fysische of DNA reactieve chemische mutagenen zoals N alkyleringsmiddel ethyl-N -nitrosourea (ENU) kan worden gebruikt om genomische instabiliteit verbeteren. Hoewel beide benaderingen kunnen aanzienlijk isHORTEN de tijd resistente klonen bereiken en follow-up sequencing moeten stringente functionele testen worden uitgevoerd op kandidaatgenen een groter aantal niet-functionele, passagiers mutaties aandienen. SNVs kan rang veroordeeld tot kansen te maximaliseren voor het identificeren van functioneel relevante mutaties. Ten eerste, de keuze van de mutaties die zijn terugkerende in onafhankelijke klonen wordt de kans op deze mutaties zijn bestuurders van de weerstand te verhogen. Bij recurrente mutaties niet geïdentificeerd, gericht op SNVs dat het mechanisme van werking van het geneesmiddel te passen (bijvoorbeeld de beoogde middel of een bekende stroomafwaartse effector van de drug target) kan zinvol zijn. Uiteindelijk is de gouden standaard is altijd experimentele evaluatie van resistentie-toekenning activiteit van de kandidaat SNVs door buitenbaarmoederlijke cDNA expressie in drug-gevoelige ouderlijke cellen. DNA versus RNA-sequencing Zodra resistente klonen werden gegenereerd, DNA en / of RNAkunnen worden gesequenced afhankelijk van de behoefte. DNA-sequencing, ofwel exome of hele genoom sequencing, zal de identificatie van de kiembaan en somatische varianten, zoals SNPs, indels toestaan ​​en kopiëren aantal varianten. Terwijl de meer kostenvriendelijke exome sequencing gericht op het genereren leest bekende coderende gebieden, zal hele genoom sequentie gegevens voor het gehele genoom die de identificatie van mutaties in niet-coderende elementen zoals versterkers of miRNAs 36 kan vergemakkelijken genereren. Aangezien genexpressiedata niet gemeten gedurende de DNA sequencing, is het moeilijk om die mutatie (s) waarschijnlijk een functioneel bestuurder voorspellen. In dit opzicht sequentie van RNA, hoewel duurder, biedt dit voordeel. Dat mutatie calling alleen uitgevoerd op expressie gebracht RNA species verhoogt de waarschijnlijkheid dat de mutatie van belang een functioneel bestuurder zijn. Naast het feit dat een meer gerichte onderzoek van mutaties voor opvolging functionele testen, RNA sequencing ookEen voordeel van de mogelijkheid om genexpressie wijzigingen, alternatieve splicing en nieuwe chimere RNA soorten, waaronder genfusies die ook kunnen fungeren als krachtige drijvende resistentieproteïnen. Bioinformatica pijplijn Bijvoorbeeld opdrachten worden verstrekt ter illustratie, maar meer gedetailleerde documentatie en handleidingen zijn verkrijgbaar bij de globale Instituut 16 en moet grondig voor het begin van NGS analyses worden gelezen. De volgende commando&#39;s zijn ontworpen voor een UNIX shell omgeving op een systeem waarop alle gereedschappen en referentiegegevens zijn vooraf geïnstalleerd. Deze opdrachten ook aannemen FASTQ bestanden met gepaarde-end reeks leest voor uit twee monsters, genaamd &quot;ouderlijke&quot; en &quot;resistent&quot; zijn ontvangen van de verkoper en geplaatst in de map &quot;data&quot;. In de meeste gevallen moet deze commando&#39;s worden aangepast of geoptimaliseerd voor een specifieke toepassing met extra command-line argmenten (bijvoorbeeld het toevoegen van &quot;-t 8&quot; om de BWA commando kunt multithreaded operatie over 8 CPU cores). Lees groepen (die uitlijningen toewijzen aan biologische monsters) dienen vaak toegevoegd aan BAM bestanden, zelfs als er slechts één monster per bam bestand, om te voldoen aan de eisen bestandsformaat voor bepaalde werktuigen. Lees groep parameters RGID, RGSM, RGPL, RGPU en RGLB kan willekeurige strings beschrijft de naam monster, sequencing platform, en een bibliotheek strategie. In vitro vs in vivo assays Hoewel verschillende resistentiemechanismen geïdentificeerd door in vitro selectie zijn gecontroleerd klinisch relevant zijn, bestaat er een mogelijkheid dat de mechanismen niet relevant of voornaamste mechanismen van klinische resistentie kunnen dienen. Een reden hiervoor kan een essentiële rol voor de micro-omgeving rijweerstand therapie, een component die mist in de experimentele protocol / d opstelling omvattentot nu toe iscussed. Inderdaad hebben verscheidene studies aangetoond dat antikankermiddelen die in staat zijn tumorcellen te doden zijn ineffectief zijn geworden wanneer de tumorcellen worden gekweekt in aanwezigheid van stromale cellen impliceert aangeboren mechanismen van resistentie door het stroma 37,38 verleend. Om dergelijke stroma-geïnduceerde verworven resistentie mechanismen te identificeren, kan men overwegen het uitvoeren van in vitro co-cultuur of in vivo tumor weerstand testen. Aangezien de eerste assay is vrij complex, velen hun toevlucht te genereren resistente tumor xenotransplantaten op de mogelijke rol van de stroma in rijweerstand pakken. Dergelijke studies hebben ontdekt zowel identieke 5 en de unieke 39 mechanismen van resistentie ten opzichte van in vitro selectie, wat impliceert dat de stroma inderdaad een rol in deze kunnen spelen. Toch moet men rekening houden met de lengte van de tijd kan nemen om deze resistente tumoren te genereren en de complexiteit van de follow-up genomische analyse-complexitie zijns als gevolg van de intra-tumorale moleculaire en cellulaire heterogeniteit. Target identificatie Naast het blootleggen resistentie mechanismen, kan deze NGS gebaseerde genomische profilering benadering ook worden toegepast om cellulaire doelwitten chemische probes identificeren. Historisch gezien hebben meerdere onpartijdige werkwijzen toegepast om de cellulaire werkingsmechanismen en de doelstellingen van laagmoleculaire stoffen met biologische activiteiten, inclusief affiniteitszuivering combinatie met kwantitatieve proteomics, gist genomische werkwijzen, RNAi screening en computationele benaderingen conclusie 40 identificeren. Als een uitbreiding op opheldering van resistentie mechanismen met behulp van NGS-gebaseerde genomische of transcriptomische profilering van fenotypisch resistente celpopulaties, identificatie van unieke terugkerende single nucleotide variaties (SNVs) of expressie veranderingen die de resistentie tegen inzichten in functionele cellulaire doelwitten van verbindingen kan bieden. Tzijn gebaseerd op het idee dat een subset van resistentiemechanismen waargenomen recurrente mutaties in genen kan betekenen dat de directe targets van de kleine moleculen coderen. Onlangs heeft een aantal rapporten gevalideerd bruikbaarheid van de benadering, met name door vermenging met andere benaderingen, waaronder grootschalige kankercellijn gevoeligheid profilering, onthullend de cellulaire doelwitten van kleine moleculen sondes 9,10.

Gedetailleerde moleculaire karakterisatie van tumor genomen door robuuste sequentietechnologieën en verbeterde data analytische instrumenten heeft geleid tot de ontdekking van belangrijke genetische veranderingen in bepaalde kankersoorten 1,2. Ontwikkeling van gerichte therapieën gericht op deze genetische afwijkingen, zoals HER2, BCR-ABL, EGFR en ALK zijn significant betere kwaliteit van leven voor patiënten 1,2. Ondanks de specificiteit van deze aanpak, de klinische respons op de meeste behandelingen is één sub-optimaal is als weerstand uiteindelijk ontstaat. Onlangs, heeft aanzienlijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van de moleculaire onderbouwing van resistentie tegen doelgerichte therapieën. Intrigerend, wordt het steeds duidelijker dat een prominente mechanisme van resistentie impliceert aanhoudende doel / route activiteit. Als een voorbeeld, androgene receptor (AR) -directed enzalutamide behandeling van prostaatkanker leidt tot verrijking van activerende mutaties in AR zelf, behoud-AR signalering output in aanwezigheid van de remmer 3-5. Deze kennis heeft geleid tot een agressieve campagne om 1) derde generatie antagonisten die kunnen blijven zowel WT en mutant-AR onderdrukken in ontwikkeling enzalutamide-resistente PCa 3 en 2) het identificeren van potentiële downstream knooppunten van AR signalering die kunnen worden gericht voor therapeutische interventie . Ook voor andere klassen van remmers zoals EGFR gericht, BRAF ABL en leiden vaak tot mutaties die de oorspronkelijke verslavende kinase pathway 1 activeren. Met de wetenschap dat verzet onvermijdelijk ontstaat bij de meeste patiënten, de ontwikkeling van benaderingen om vlot te brengen deze mechanismen aan het licht zal de ontwikkeling van effectieve follow-up therapieën mogelijk te maken. Een benadering die wordt veel gebruikt is om de genomica van klinische refractaire tumoren ten opzichte van eerder behandelde of -gevoelige tumoren verrijkingen / aan consumenten in de genetische laesies die vatbaar zijn voor d kunnen identificeren analyserentapijt ontdekking. Ondanks de belofte er twee belangrijke risico van deze benadering snelle ontdekking belemmeren. Ten eerste, het verkrijgen van tijdige toegang tot tumor materiaal voor genomische ondervraging kan als een belangrijke hindernis te dienen in het verplaatsen van therapie om te genezen. Ten tweede kan deconvolutie van de talloze genetische laesies in de resistente instelling uitdagend omdat tumoren significant intratumorale heterogeniteit 6,7 kunnen presenteren. In het licht van deze uitdagingen is er toegenomen afhankelijkheid van preklinische ontdekking van resistentie mechanismen. Deze benadering kan gekende sterke resistentiemechanismen toelaten voordat de klinische proeven 1 dat alternatieve klinische behandeling strategieën kunnen leiden bij patiënten die deze mechanismen hetzij vóór de behandeling of na aanvang van resistentie dragen. Een van deze preklinische discovery tool dat wordt veel gebruikt is om onpartijdige functionele RNAi screens van toepassing. Voor examenple, Whittaker en collega&#39;s toegepast een genoom-schaal RNAi scherm te identificeren dat NF1 verlies bemiddelt weerstand tegen RAF en MEK-remmers door aanhoudende MAPK route activering 8. Deze bevindingen bleken klinisch relevant als verlies-van-functie mutaties in NF1 waargenomen in BRAF -mutant tumorcellen die intrinsiek resistent RAF remming en melanoom tumoren resistent activatie 8 vemurafenib zijn. Ondanks het succes van deze benadering veel klinisch relevante doelen vaak niet geïdentificeerd, vermoedelijk als gevolg van het verlies-van-functie voorspanning van deze aanpak. Daarentegen minder bevooroordeelde instrument voor preklinisch van resistentiemechanismen omvat de generatie van resistente cellijnen bij langdurige blootstelling aan de verbinding van belang in combinatie met NGS-gebaseerde genomische of transcriptoom profielen. Deze benadering is met succes uitgevoerd bij verschillende groepen te identificeren spontaneterugkerende single nucleotide varianten of expressie veranderingen die weerstand 5,9,10 schakelen. Zo werd een terugkerend F876L mutatie in AR onlangs ontdekt in resistente klonen in vitro 3-5 en xenograft tumoren in vivo 5 voorafgaand aan vaststelling van deze mutatie in de kliniek 4. Zeer recent Bhang en medewerkers (2015) 11 gebruikt ClonTracer twee klinisch relevante modellen die meeste resistente klonen die zich voordoen tijdens langdurige blootstelling drug maakten deel uit van een reeds bestaande subpopulatie wijst dat functioneel relevant mutaties vertonen waarschijnlijk reeds bestaand die raken geselecteerd tijdens selectie 11. In tegenstelling tot de genomische profilering van tumoren eerder besproken, deze benadering geniet minder heterogeniteit als &quot;homogene&quot; resistente klonen worden gebruikt voor de analyse nauwkeuriger genetische dissectie van potentiële drijvende vergemakkelijken. Furthermerts, interessant genoeg, naast de mogelijkheid voor het blootleggen resistentiemechanismen, deze werkwijze ook worden toegepast op de cellulaire werkingsmechanismen en doelstellingen van bioactieve kleine moleculen die deze informatie bekend 10 identificeren. Gezien de duidelijke voordelen en de vele toepassingen van deze aanpak, hier presenteren we een protocol detaillering succesvolle implementatie van een dergelijke preklinische scherm om het potentieel voor klinisch belangrijke ontdekkingen te maximaliseren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Om de kans op het ontdekken belangrijkste functionele bestuurders weerstand te maximaliseren, selecteert cel klonen voor expansie fenotypische testen en sequencing. Zoals weergegeven in figuur 4A, HCT116 cellen behandeld langdurig met cytotoxische verbinding # 1 tot de spontane ontstaan ​​van resistente klonen die blijven groeien tijdens de behandeling (gestippelde zwarte cirkels). Deze klonen werden opgepikt met behulp aanpak # 1 uit figuur 3 en vervolgens geëxpandeerd voor fenotypische analyse. Zoals getoond in figuur 4B, resistente klonen 1-3 vertoonden allemaal een significante weerstand tegen verbinding # 1 en de nauwe analoge verbinding # 2 (grotere levensvatbaarheid / groei), terwijl alle klonen vertoonden gevoeligheid voor een niet verwante cytotoxische verbinding Velcade. Na bevestiging van fenotypische resistentie, werd gDNA geïsoleerd en voor de hele exome sequencing analyse ingediend. Bioinformatica instrumenten werden toegepast om een ​​beperking in op deze structurele varianten diezijn 1) terugkerende en 2) het potentieel voor functionele effect (Figuur 5A). Structurele varianten die deze twee criteria voldaan werden bevestigd door een onafhankelijke sequencing tool. Zoals getoond in figuur 5B, een heterozygote missense mutatie die werd geïdentificeerd met behulp hele exome sequencing werd bevestigd met behulp van de Sanger sequencing methode (bovenste paneel, WT sequentie, onderste paneel, gemuteerde sequentie). Na sequentiebevestiging, de ouderlijke cellijn oorspronkelijk voor de resistentietest is genetisch gemanipuleerd om de mutant cDNA expressie functioneel bevestigt de rol van de mutatie. Zoals weergegeven in figuur 6, terwijl overexpressie van de WT cDNA geen resistentie, gedwongen expressie van de mutant cDNA aanzienlijk verleend fenotypische resistentie tegen verbinding # 1, bevestiging van de functionele rol van deze structurele variatie bestuurder weerstand. Alle reagentia voor dit experiment worden uiteengezet in tabel 1 </s<html> trong&gt;. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Figuur 1. Indeling van de test en controle platen. Blauwe tint, samengestelde behandeling putten. Witte schaduw, enige medium. Verbindingen worden serieel verdund 1: 4 en worden toegediend in triplo (BD of EG). 2 verbindingen kunnen worden toegepast per plaat. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger levensvatbaarheid bochten. Rode stippellijn dag 0 lezen. X-as geeft toenemende doses van verbinding naar rechts en y-as geeft levensvatbaarheid in vergelijking met DMSO controleputjes. GI 100 = dosis gebruikt om 100% groeiremming te bereiken; GI 50 = dosis gebruikt om de levensvatbaarheid verlagen tot 50% DMSO controle. _upload / 52.879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. Twee benaderingen voor het plukken resistente klonen voor uitbreiding. Aanpak 1- gebruik pipet te halen en over te dragen goed gedefinieerde klonen tot 48-well platen. Benadering 2- gebruik trypsine-doordrenkte klonen schijven om klonen te heffen en transfer naar 48-well platen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> Figuur 4. Bevestiging van de weerstand bereikt voor HCT116 klonen tot verbinding # 1 in vitro. (A) Verbinding # 1 HCT116-resistente klonen ontstaan ​​na continue drie weken selectie. (B) Levensvatbaarheid van controle en resistente klonen werd getest na 72 uur behandeling met verschillende verbindingen. Verbinding # 2 is een close analogon van verbinding # 1. Velcade werd gebruikt als controle cytotoxisch middel. De gegevens zijn weergegeven als gemiddelde + standaardafwijking van drie biologische repliceert. Figuur 5. Identificatie van een unieke, terugkerende mutatie (single nucleotide varianten, SNVs) in gen A in verbinding # 1-resistente HCT116 klonen. (A) Werk stroom naar SNVs aanwezig in alle resistente klonen te identificeren en zal naar verwachting een hoge functionele impact door MutationAssessor. (B) Bevestiging van de mutatie in het gen A door Sanger sequentiebepaling. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Figuur 6. Re-expressie van gemuteerde gen A verleend resistentie tegen verbinding # 1 in vitro. Levensvatbaarheid van de HCT116 gemanipuleerde cellijnen werd getest na 72 uur behandeling met Verbinding # 1. HCT 116-WT of mutante cellijnen worden stabiel tot expressie WT of mutant cDNA van gen A, respectievelijk. De gegevens zijn weergegeven als gemiddelde + standaarddeviatie of drie biologische repliceert. <table><tbody><tr><td> Monster Naam </td><td> Aminozuur </td><td colspan="2"> Primaire Tissue </td><td> Zygositeit </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> hals </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> hals </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> huid </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> P.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> eierstok </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> eierstok </td><td> Heterozygote </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> borst </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> p.? </td><td colspan="2"> prostaat </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> p.? </td><td colspan="2"> dikke darm </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> Nalm-6 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> dikke darm </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> endometrium </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> endometrium </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr></tbody></table> Tabel 1. MSH2 -mutated cellijnen. Cellijn (sample naam), aminozuursubstitutie, het geslacht van de oorsprong en de zygositeit worden aangegeven. <table><tbody><tr><td> Monster Naam </td><td> Aminozuur </td><td colspan="2"> Primaire Tissue </td><td> Zygositeit </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> dikke darm </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> p.? </td&gt; <td colspan="2"> prostaat </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> dikke darm </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> eierstok </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> maag </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> p.? </td><td colspan="2"> huid </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> REH </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homozygote </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> P.0? </td><td colspan="2"> eierstok </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> dikke darm </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> dikke darm </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> alvleesklier </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> alvleesklier </td><td> Heterozygote </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> alvleesklier </td><td> Heterozygote </td></tr></tbody></table> Tabel 2. MLH1 -mutated cellijnen. Cellijn (sample naam), aminozuursubstitutie, het geslacht van de oorsprong en de zygositeit worden aangegeven.

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms at JoVE.com

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Het beoordelen Myogene Response en vasoactiviteit In Resistance Mesenteriale slagaders behulp Pressure myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Een betaalbare HIV-1 drug-resistentie Monitoring Methode voor het met beperkte middelen

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Slow-release Drug Delivery via Elvax 40W aan de Rat Retina: Implicaties voor de behandeling van chronische voorwaarden

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gene Transfer Techniek en<em&gt; In vitro</em&gt; Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Adapted Resistance Training Improves Strength in Eight Weeks in Individuals with Multiple Sclerosis

Aangepast Resistance Training verbetert Sterkte in acht weken bij personen met Multiple Sclerose

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

Een Model klinisch relevante Hypoxie bij mensen simuleren

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

Een cel cultuur Model van weerstand slagaders

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...