Name: implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00
Duration: 8 min 46 s
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The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. Évaluer IG 50 pour le composé (s) d&#39;intérêt <ol><li> Générer courbe (s) de croissance pour les lignées cellulaires d&#39;intérêt pour évaluer la densité de semis appropriée. Tracer le nombre de cellules à différents points dans le temps suivant l&#39;ensemencement (jours 2, 4, 6 et 8) par rapport au jour 0. Cela fournira un taux relatif de croissance de la lignée cellulaire d&#39;intérêt et devrait être utilisé pour évaluer la densité d&#39;ensemencement initiale telle que confluence est pas atteint dans des plaques 96 puits dans les 7 jours. </li><li> Une fois que les courbes de croissance ont été déterminées, graines nombre approprié de cellules claires, plaques 96 puits à fond non transparentes dans 100 ul de milieu de cellules pour évaluer GI 50. Ensemencer le nombre de cellules basées sur la lignée cellulaire utilisée et déterminé en 1.1. Typiquement, semences 3x10 3 cellules pour les lignes à croissance rapide cellule avec un temps de doublement de ~ 24 heures, par exemple., HCT116. <ol><li> Préparer une plaque d&#39;essai (jour-1). Pour la plaque d&#39;essai, les cellules de semences à densité désirée dans 100 pi de milieu de culture in puits ombragées en bleu (Figure 1). Wells a souligné en blanc ne contiennent que des médias. </li><li> Préparer une plaque de commande (jour 1). Pour la plaque de commande, ensemencer la même densité de cellules comme dans l&#39;étape 1.2.1 dans 100 pi de milieu de culture dans une plaque de 96 puits séparé. Cette «Journée 0 &#39;lecture aidera dans l&#39;interprétation de la nature cytostatique / cytotoxique des composés en cours d&#39;analyse (Figure 2). </li></ol></li><li> Le lendemain (jour 0), lire la plaque de commande. Equilibrer luminescente réactif de viabilité cellulaire (substrat CellTiter-Glo mélangé avec un tampon selon les instructions du fabricant) à température ambiante et mélanger doucement en inversant le contenu pour obtenir une solution homogène. Ajouter 80 pi de réactif aux 100 pi de cellules / mix média et agiter le contenu pendant 30 min pour induire la lyse cellulaire. <ol><li> Luminescence d&#39;enregistrement avec un luminomètre réglé à une exposition de 0,1-1,0 sec et la détection longueur d&#39;onde de 560 nm. </li></ol></li><li> Ajouter composés à tester (composésd&#39;intérêt) pour doser plaques (jour 0). Faire une dilution de 1: 4 de série de composés dans du DMSO à 200x concentration finale pour un total de 10 concentrations (9 dilutions contenant le composé et un DMSO seulement, plaque composé). Comme un point de départ initial, viser une dose 200x plus bas de 0,03 um et une dose maximale de 2.000 uM (volume final de 200 pi). </li><li> Ajouter composés dilués en série au moyen de faire un mix composé milieu à 10x concentration finale (volume final de 100 pi, plaque intermédiaire). Conservez la plaque de composé à -20 ° C pour une utilisation au jour 3 de l&#39;essai. Ajouter 10 pi de composé de mélange fluide cellules en triple telle sorte que la dose la plus élevée est de 10 uM (par ex., Les lignes B, C et D, jour 0) (figure 1). Incuber les plaques d&#39;essai pendant 3 jours à 37 ° C. Jeter plaque intermédiaire (s) après utilisation. </li><li> Au jour 3, préparer un mélange de 400 ul 1x composé-milieu en utilisant les plaques de composé préparé à 1,4. Inversez les plaques d&#39;essai pour enlever les médias et les éponger sur l&#39;autoserviettes en papier CLAVED 2-3X à supprimer les médias résiduelle. Ajouter composé / médias (100 pl / puits) aux puits ombragées en bleu et ajouter 100 ul de médias à périmètre puits pour éviter l&#39;évaporation (Figure 1). Re-incuber les plaques de dosage à 37 ° C pendant encore 3 jours. </li><li> Au jour 6, évaluer le nombre relatif de cellules viables en effectuant une lecture de luminescence comme décrit dans l&#39;étape 1.3. </li><li> Utilisez le jour 0 de lecture pour évaluer la nature statique / toxique de composés. Agents toxiques induisent l&#39;apoptose alors que les agents cytostatiques induisent un arrêt du cycle cellulaire. Si le composé est toxique (jour 6 lecture est inférieure à jour 0 lecture), envisager de choisir GI 50 et GI 50 x 5 concentrations pour des tests de résistance. Toutefois, si le composé induit une stase (égal ou supérieur à d0 lecture), examiner IG IG 100 et 100 x5 pour des essais de résistance (figure 2). </li></ol> 2. Mise en place la résistance aux médicaments dosages <ol><li> Si l&#39;esprit de travailha agent cytostatique, les cellules de semence à une confluence de 30 à 40% dans 150 mm 2 boîtes de culture de tissu (volume = 30 ml) pour l&#39;essai de résistance. Si vous travaillez avec un agent toxique, ensemencer à une confluence de 70-80%. </li><li> Pour les lignées cellulaires qui abritent un mécanisme intact mismatch repair (MMR), incuber les cellules de l&#39;étape 2.1 O / N à 37 ° C avec le cancérogène N-éthyl-N-nitrosourée (FRA). Traiter les cellules avec 30 pi d&#39;une solution stock de 50 mg / ml FRA (concentration finale de 50 pg / ml) pour améliorer l&#39;instabilité génomique. Pour les lignées cellulaires qui ont un MMR défectueux (tableaux 2 et 3), le traitement par ENU ou d&#39;autres substances cancérogènes peut ne pas être nécessaire. <ol><li> Pour d&#39;autres lignées cellulaires, déterminer MMR-déficit par des critères NCI utilisant l&#39;instabilité des microsatellites 12, ou sur la base de la caractérisation publiée en utilisant des tests d&#39;instabilité microsatellite ou profilage génomique / épigénomique des gènes MMR 13-15. </li></ol></li><li> Cellules traiter avec le composé (s) de test deintérêt à la concentration déterminée à l&#39;étape 1.8. Pour les composés hautement toxiques qui provoquent la mort des cellules dans un typique dosage 10 viabilité de trois jours, commencer avec un traitement à faible dose (c.-à-GI 50) et progressivement augmenter la concentration (multiples de GI 50) de composé toutes les 2-3 semaines jusqu&#39;à robuste résistance est observée. Reconstituer les médias et composé tous les 3 jours. </li><li> Une fois la sélection a été lancé, le changement des médias / composé mélanger tous les 3-4 jours jusqu&#39;à ce que les clones résistants émergent. Résistance, par définition, se dégage lorsque les cellules traitées présentent une plus grande croissance / viabilité pendant le traitement médicamenteux par rapport au traitement aigu de cellules témoins traitées au DMSO. </li></ol> 3. Isoler seule cellule Clones <ol><li> Examinez boîte de culture en utilisant la microscopie à contraste de phase (grossissement 40x) pour les clusters de cellules viables. </li><li> Marquer les clones satisfaisants au fond du plat avec un marqueur. Choisissez clones qui sont de taille moyenne (de plus grandes colonies peutprovenir de plusieurs cellules) et bien isolé des autres colonies. Choisissez clones en utilisant une des deux approches décrites dans l&#39;étape 3.3. </li><li> Approche 1: aide d&#39;une pipette (Figure 3) <ol><li> Retirez le support de croissance et rincer avec 1x PBS pour éliminer toutes les cellules flottantes. </li><li> Utiliser les marques noires de guide à «picking» clones avec pipette (attaché à pipette, p200 préférence). </li><li> Clones de transfert dans des plaques à 48 puits avec 200 pi du milieu frais (avec une concentration moitié de composé afin de permettre une récupération optimale des cellules). </li><li> Laisser les cellules récupérer pendant 2-3 jours avant d&#39;ajouter 200 pi de Fresh Media / concentration du composé idéal. </li><li> Continuer à changer de support / composé tous les 3-4 jours et de continuer à élargir clones. </li></ol></li><li> Approche 2: Utilisation de clonage des disques (Figure 3) <ol><li> Marquez clones comme décrit dans l&#39;étape 3.2. </li><li> Placer les disques de clonage de 3 mm dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 5 ml de 0,25% de trypsin-EDTA pendant 2 min. </li><li> Aspirer le milieu de plat contenant des clones résistants et superposer clones avec de la trypsine imbibé disques de clonage aide de pinces stériles jetables. </li><li> Laissez pendant 1-2 min, en fonction de la façon dont facilement clones décollent les plaques, dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Pick-up disques de clonage utilisant des pinces stériles et transférer dans des plaques à 48 puits avec les médias 200 pi frais et la moitié concentration du composé. </li><li> Pipette et doucement pour déloger les cellules à partir de disques de clonage et incuber O / N à 37 ° C (laisser le clonage des disques dans les puits). </li><li> Le lendemain matin, retirez les disques de clonage à partir de plaques à 48 puits et de reconstituer les puits avec 200 pi frais médias / composé (la concentration du composé la moitié idéal). </li><li> Trois jours plus tard, reconstituer les médias avec la concentration idéale du composé. </li><li> Continuer à modifier le support / composé tous les 3-4 jours et de continuer à élargir clones. </li></ol></li></ol> 4. Évaluer Degré de Résistance des clones isolés <ol><li> Une fois 10-20 colonies sont étendues, de générer des courbes GI 50 comme décrit à l&#39;étape 1 pour évaluer le degré de résistance. </li><li> Toujours inclure populations témoins traitées avec du DMSO pendant le processus de sélection. Il est très probable que le spectre de la résistance va être grande (certains montrant partielle tandis que d&#39;autres montrant une résistance complète). Recueillir quelques clones de chacune de ces classes que le mécanisme de résistance peut varier entre les deux groupes. </li></ol> 5. Séquençage de nouvelle génération <ol><li> Isoler 2 millions de cellules (contrôle et clones résistants) (500 g pendant 5 min) dans 15 ml des flacons coniques pour deux ADNg et la collecte de ARN (donc 2 x 2 millions). </li><li> Laver deux fois avec PBS 1x et de geler des pastilles en -80 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;isolement. </li><li> Utilisation d&#39;un kit commercial d&#39;extraction pour isoler l&#39;ARN ou l&#39;ADNg selon le protocole du fabricant. </li><li> Soumettre des échantillons pour le séquençage de prochaine générationen utilisant le protocole du fournisseur 10. </li></ol> 6. bioinformatique analyse des échantillons (séquençage exome) <ol><li> Preprocess séquence données selon un ADN suivants pipeline 16 des meilleures pratiques. <ol><li> Map toutes les lectures de référencer GRCh37 du génome humain en utilisant BWA 17. Autre non compressés alignements SAM formatés au format compressé avec BAM samtools 18. Trier les alignements par coordonnent avec samtools. Ajouter des groupes de lecture à l&#39;aide de Picard. (Pour BWA spécifique, samtools et Picard commandes, voir le texte complémentaire 1, lignes 1-4) </li><li> Mark lit tous les doublons en utilisant les MarkDuplicates commande à partir de l&#39;outil Picard réglé 19. Indice de ce fichier avec samtools. (Texte complémentaire 1, lignes 5-6) </li><li> Pour minimiser les bases mésappariées dans toutes les lectures, lectures localement à réaligner les régions abritant de petites insertions ou délétions utilisant un realigner indel 20. (Texte complémentaire 1, lignes 7-8) </li><li> Pour améliorer encore la Accuracy de la variante appel, empiriquement recalibrer les scores de qualité de base en utilisant un outil pointage de recalibrage de la qualité de base. L&#39;outil d&#39;étalonnage de la qualité de base ne doit pas seulement bon score initial de la qualité, mais aussi prendre en compte la covariation de plusieurs fonctionnalités, y compris groupe de lire, cycle de la machine, la position de base, et le contexte de dinucléotide (bases actuelles précédents +). Générer BAM recalibré avec PrintReads Picard. (Pour les commandes spécifiques pour cette étape, voir le texte complémentaire 1, lignes 9-10) </li><li> Répétez les étapes 6.1.1 à travers 6.1.4 (Texte complémentaire 1, lignes 1-10) pour chaque échantillon séquencé. </li></ol></li><li> Identifier la variation d&#39;un seul nucléotide (SNV) dans chaque clone en utilisant une variante jumelé appelant tool19, 21-23. Pour chaque clone séquencé, exécutez variante jumelé appelant utilisant le clone parental comme la correspondance &quot;normal&quot;. (Texte complémentaire 1, ligne 11) </li><li> Filtrez récurrents, variantes de haute qualité et se préparer pour l&#39;annotation avec un outil d&#39;annotation de 24 variante. Plus accorder la priorité variants pas commun à tous les clones résistants. (Voir le texte de R dans le texte complémentaire 2) </li><li> Annoter variantes avec un outil d&#39;annotation 25, 26. De nombreux outils d&#39;annotation variante ont une application web d&#39;accompagnement permettant aux données d&#39;être téléchargées et traitées par un serveur distant. </li><li> Utilisez un outil de prédiction de l&#39;impact fonctionnel 27-29 à prioriser ces variantes prédite d&#39;avoir impact fonctionnel élevé. Comme variante annotation, plusieurs outils sont disponibles pour la prédiction de l&#39;impact fonctionnel à travers une interface web. </li></ol>

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B., Los, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DNA+mismatch+repair:+effects+on+the+rate+of+mutation+to+drug+resistance.">Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance.</a> J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).</li><li>Kotani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+miR-128b+gene+reduces+miRNA+processing+and+leads+to+glucocorticoid+resistance+of+MLL-AF4+acute+lymphocytic+leukemia+cells.">A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).</li><li>Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stroma-mediated+resistance+to+FLT3+inhibitors+in+FLT3-ITD+AML+is+mediated+by+persistent+activation+of+extracellular+regulated+kinase.">Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase.</a> Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).</li><li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade.">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li><li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li></ol>

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Sélection de la ligne (s) de cellules: Caractérisation de l&#39;état génétique et l&#39;instabilité génomique Sans aucun doute, le facteur le plus critique dans la découverte de succès cliniquement pertinents les mécanismes de résistance est la sélection initiale de la lignée cellulaire. Deux facteurs doivent être considérés. Tout d&#39;abord, viser à sélectionner la ligne (s) de la cellule de la même lignée / sous-type hébergeant les caractéristiques génétiques définissant de la maladie (par exemple., BRAF V600E dans le mélanome). Interrogation des données transcriptomiques et de mutation publiquement disponibles pour les deux lignées cellulaires et les tumeurs primaires 30-32 / métastases pour une variété d&#39;indications 33,34 facilitera le processus de sélection. Bien que l&#39;identification de lignées cellulaires avec des altérations génétiques cliniquement pertinentes est idéal, dans certains cas, cela peut ne pas être possible en raison du manque de lignées cellulaires disponibles ou faisable en raison de facteurs tels que la difficulté et la longueur du processus de sélection. <p class="jove_content"&gt; En ce qui concerne le point mentionné ci-dessus, un deuxième facteur à considérer, puis lors de la sélection de la lignée cellulaire est la facilité ou de la faisabilité de la résistance criblage en utilisant la ligne souhaitée. Par exemple, des facteurs tels que la prolifération et les taux de mutation intrinsèques peuvent influer grandement sur la vitesse de la découverte. A cet effet, des lignées cellulaires peuvent être utilisés avec une cinétique de croissance plus rapides et déficient dans les mécanismes ADN MMR dans l&#39;espoir que émergence de la résistance spontanée peut être accélérée 35. Sur la base de la base de données cosmique, plusieurs lignées de cellules de candidat existent avec déficience en l&#39;une des deux gènes MMR fréquemment mutés, MLH1 ou MSH2 (tableaux 2 et 3). Alternativement, si les lignées cellulaires d&#39;intérêt ne existent pas défauts de roulement du TMM, le traitement aigu avec mutagènes chimiques physiques ou de l&#39;ADN réactifs tels que l&#39;agent alkylant N -nitrosourea de la N (FRA) peut être utilisé pour améliorer l&#39;instabilité génomique. Bien que les deux approches peuvent significativement SHorten le temps pour atteindre clones résistants et de suivi séquençage, tests fonctionnels stricte devrait être effectuée sur des gènes candidats comme un plus grand nombre de non-fonctionnelle, les mutations de passagers sont susceptibles d&#39;émerger. SNVs peut être rang ordonné de maximiser les chances d&#39;identifier des mutations fonctionnellement pertinents. Tout d&#39;abord, le choix de ces mutations qui sont récurrents dans les clones indépendants augmentera la probabilité de ces mutations sont des conducteurs de résistance. Dans le cas des mutations récurrentes ne sont pas identifiés, en se concentrant sur SNVs qui correspondent le mécanisme d&#39;action du médicament (par exemple, la cible de médicament ou d&#39;un effecteur en aval connu de la cible de la drogue) peuvent être significatifs. En fin de compte, l&#39;étalon-or est toujours une évaluation expérimentale de l&#39;activité conférant une résistance à des SNVs candidats par l&#39;expression de l&#39;ADNc ectopique dans les cellules parentales sensibles aux médicaments. Le séquençage de l&#39;ADN vs ARN Une fois que les clones résistants ont été générés, l&#39;ADN et / ou ARNpeuvent être séquencées selon le besoin. Séquençage de l&#39;ADN, soit exome ou le séquençage du génome entier, permettra d&#39;identifier les lignées germinales et somatiques variantes, comme SNP, indels et copier nombre des variantes. Alors que le plus séquençage de l&#39;exome coût-friendly se concentre sur génératrice lit à partir de régions codantes connues, le séquençage du génome entier va générer des données de séquençage de la totalité du génome qui peut faciliter l&#39;identification de mutations dans les éléments non-codants tels que des amplificateurs ou des miARN 36. Cependant, étant donné que les données d&#39;expression génique est mesuré pendant pas séquençage de l&#39;ADN, il est difficile de prédire quels mutation (s) est susceptible d&#39;être un conducteur fonctionnel. À cet égard, le séquençage de l&#39;ARN, bien que plus coûteux, offre cet avantage. Le fait que la mutation appel est effectuée uniquement sur les espèces d&#39;ARN exprimées augmente la probabilité que la mutation d&#39;intérêt peut être un moteur fonctionnel. En plus de permettre une enquête plus ciblée des mutations pour le test fonctionnel suivi, le séquençage de l&#39;ARN aussiprésente l&#39;avantage supplémentaire d&#39;être en mesure d&#39;identifier les altérations des gènes d&#39;expression, l&#39;épissage alternatif et de nouvelles espèces d&#39;ARN chimères, y compris des fusions de gènes qui peuvent également servir en tant que conducteurs puissants de la résistance. Pipeline bioinformatique Des exemples de commandes sont fournis à titre d&#39;illustration, mais une documentation plus détaillée et des tutoriels sont disponibles sur le Broad Institute 16 et doivent être lus attentivement avant de commencer l&#39;analyse des NGS. Les commandes suivantes sont conçues pour un environnement de shell UNIX sur un système sur lequel tous les outils et les données de référence ont été pré-installé. Ces commandes supposent également jumelé contenant la séquence de fin fichiers FASTQ lit à partir de deux échantillons, nommé &quot;parentale&quot; et &quot;résistante&quot;, ont été reçus par le vendeur et placé dans le répertoire &quot;data&quot;. Dans la plupart des cas, ces commandes devraient être adaptés ou optimisés pour une application spécifique à l&#39;aide supplémentaire arg ligne de commandements (par exemple, en ajoutant &quot;-t 8&quot; à la commande BWA permet un fonctionnement multithread sur 8 cœurs de processeur). Lisez les groupes (qui attribuent alignements à des échantillons biologiques), doivent souvent être ajoutés à des fichiers BAM même si il ya un seul échantillon par fichier bam, afin de se conformer aux exigences en matière de format de fichier pour certains outils. Lire groupe paramètres RGID, RGSM, RGPL, RGPU et GLRB peut être des chaînes, décrivant le nom de l&#39;échantillon, la plate-forme de séquençage, et la stratégie de la bibliothèque. In vitro contre des dosages in vivo Bien que plusieurs mécanismes de résistance identifiés par sélection in vitro ont été vérifiés comme cliniquement pertinents, il existe une possibilité que les mécanismes ne peuvent pas servir de mécanismes pertinents ou prédominantes de résistance clinique. Une raison à cela peut inclure un rôle essentiel pour le micro-environnement de la résistance à la thérapie de conduite, un élément qui est dépourvu dans le protocole expérimental / setup discussed jusqu&#39;ici. En effet, plusieurs études ont montré que les agents anti-cancéreux qui sont capables de tuer les cellules tumorales sont rendues inefficaces lorsque les cellules tumorales sont mises en culture en présence de cellules stromales qui impliquent des mécanismes innés de résistance conféré par le stroma 37,38. Pour identifier ces mécanismes de résistance acquis stroma-induite, on peut envisager d&#39;effectuer la co-culture in vitro ou in vivo, des essais de résistance de la tumeur. Depuis l&#39;ancien dosage est assez complexe, beaucoup ont recours à générer des xénogreffes de tumeurs résistantes aux médicaments pour traiter le rôle potentiel du stroma en résistance à l&#39;avancement. Ces études ont permis de découvrir deux identiques 5 et 39 uniques mécanismes de résistance par rapport à la sélection in vitro, ce qui implique que le stroma peut en effet jouer un rôle dans cette dernière. Cependant, il faut être conscient de la longueur de temps cela peut prendre pour générer de telles tumeurs résistantes et la complexité du suivi génomique analyse-complexities en raison de l&#39;hétérogénéité cellulaire et moléculaire intra-tumorale. Identification de la cible En plus de découvrir les mécanismes de résistance aux médicaments, cette approche de profilage génomique base-NGS peut également être appliquée pour identifier les cibles cellulaires de sondes chimiques. Historiquement, plusieurs méthodes impartiales ont été utilisées pour identifier les mécanismes cellulaires de l&#39;action et des cibles de faible poids moléculaire produits chimiques ayant des activités biologiques, y compris la purification d&#39;affinité couplée à la protéomique quantitative, levure méthodes génomiques, le dépistage ARNi, et l&#39;inférence de calcul approches 40. Dans le prolongement de l&#39;élucidation des mécanismes de résistance aux médicaments en utilisant le profilage génomique ou transcriptomique base-NGS des populations de cellules phénotypiquement résistantes, l&#39;identification des variations uniques récurrentes nucléotidiques simples (SNVs) ou des modifications d&#39;expression qui permettent la résistance peut offrir un aperçu des cibles cellulaires fonctionnelles de composés. Tson est basé sur l&#39;idée qu&#39;un sous-ensemble des mécanismes de résistance observés peut impliquer mutations récurrentes dans les gènes qui codent pour les protéines cibles directes de la petite molécule. Récemment, plusieurs rapports ont validé l&#39;utilité de l&#39;approche, en particulier en se combinant avec d&#39;autres approches, y compris à grande échelle lignée cellulaire de cancer sensibilité profilage, de révéler les cibles cellulaires de petites molécules sondes 9,10.

Caractérisation moléculaire détaillée du génome de la tumeur par les technologies de séquençage robustes et outils d&#39;analyse de données améliorée a conduit à la découverte d&#39;altérations génétiques dans les principaux types spécifiques de cancer 1,2. Développement de thérapies ciblées visant à ces lésions génétiques, comme HER2, BCR-ABL, EGFR et ALK, ont considérablement amélioré la qualité de vie des patients 1,2. Cependant, malgré la spécificité de cette approche, la réponse clinique à la plupart des thérapies individuelles a été sous-optimale que la résistance se dégage finalement. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés dans la compréhension des fondements moléculaires de la résistance aux thérapies ciblées. Curieusement, il devient évident qu&#39;un mécanisme de premier plan de la résistance implique une activité cible / voie persistante. Comme un cas au point, récepteur des androgènes (AR) -directed traitement enzalutamide du cancer de la prostate conduit à un enrichissement des mutations activatrices dans AR lui-même, le maintien AR-signalisation output en présence de l&#39;inhibiteur de 3-5. Cette connaissance a conduit à une campagne agressive pour 1) développer des tiers antagonistes de production qui peuvent continuer à supprimer à la fois WT et la fonction mutant-AR dans enzalutamide résistant CaP 3 et 2) identifier les noeuds en aval potentiels de signalisation AR pouvant être ciblés pour une intervention thérapeutique . De même, la résistance à d&#39;autres classes d&#39;inhibiteurs tels que ceux ciblant l&#39;EGFR, BRAF et ABL conduisent souvent à des mutations qui réactivent la kinase addictif origine 1. Avec la connaissance que la résistance émerge inévitablement dans la plupart des patients, développer des approches pour mettre rapidement ces mécanismes à la lumière permettra développement de thérapies de suivi efficaces. Une approche qui est largement utilisé est d&#39;analyser les génomique des tumeurs réfractaires cliniques par rapport à tumeurs naïfs de traitement ou -sensibles pour identifier les enrichissements / épuisement des lésions génétiques qui peuvent se prêter à dtapis découverte. Malgré sa promesse, il ya deux grands engagements de cette approche qui entravent la découverte rapide. Tout d&#39;abord, l&#39;accès en temps opportun à la matière de la tumeur pour interrogatoire génomique peut servir comme un obstacle important dans le déplacement de la thérapie pour guérir. Deuxièmement, déconvolution de la myriade des lésions génétiques dans le cadre résistante peut être difficile puisque les tumeurs peuvent présenter importante hétérogénéité intra-tumorale 6,7. À la lumière de ces défis, il a été un recours accru à la découverte préclinique de mécanismes de résistance. Cette approche peut permettre l&#39;identification des mécanismes de résistance importants avant les essais cliniques 1 qui peuvent guider les stratégies de gestion alternatives clinique chez les patients qui portent ces mécanismes soit avant le traitement ou après le début de la résistance. Un tel outil de découverte préclinique qui est largement utilisée est d&#39;appliquer écrans ARNi fonctionnels impartiales. Pour examenple, Whittaker et ses collègues ont utilisé un écran l&#39;échelle du génome ARNi pour identifier que la perte NF1 médie une résistance aux inhibiteurs de la RAF et de MEK par voie MAPK soutenue activation 8. Ces résultats ont été jugés cliniquement pertinente des mutations perte de fonction dans NF1 ont été observés dans les cellules tumorales -mutant BRAF qui sont intrinsèquement résistante à l&#39;inhibition de la RAF et dans les tumeurs de mélanome résistantes à vemurafenib activation 8. Toutefois, malgré le succès de cette approche, de nombreuses cibles cliniquement pertinentes sont souvent pas identifiés, sans doute en raison de la partialité de cette approche de perte de fonction. En revanche, un outil de découverte moins biaisée préclinique des mécanismes de résistance implique la génération de lignées cellulaires résistantes à travers une exposition prolongée au composé d&#39;intérêt couplé avec le profilage génomique ou transcriptomique à base de NGS. Cette approche a été mise en œuvre avec succès par plusieurs groupes pour identifier spontanéeVariantes de nucléotides ou d&#39;expression simples modifications récurrentes qui permettent la résistance 5,9,10. Par exemple, une mutation F876L récurrent dans AR a été récemment découvert dans les clones résistants in vitro et dans des tumeurs 3-5 xénogreffe in vivo 5 avant l&#39;identification de cette mutation dans la clinique 4. Très récemment, Bhang et ses collègues (2015) 11 utilisé ClonTracer en deux modèles cliniquement pertinents pour montrer que la majorité des clones résistants qui se posent lors de l&#39;exposition de drogue prolongée faisaient partie d&#39;une sous-population pré-existante qui suggère que les mutations les plus fonctionnellement pertinents sont probablement déjà pré-existante qui deviennent sélectionné lors de la sélection pour 11. Contrairement au profilage génomique des tumeurs évoquées plus haut, cette approche bénéficie d&#39;hétérogénéité moins homogènes comme «clones résistants» sont utilisés pour faciliter la dissection génétique analyse plus précise des conducteurs potentiels. E plusminerai, excitante, en plus de la possibilité de découvrir les mécanismes de résistance, cette méthode peut également être appliquée pour identifier les mécanismes cellulaires de l&#39;action et des cibles de petites molécules bioactives pour lesquelles cette information est inconnue 10. Compte tenu des avantages clairs et les multiples usages de cette approche, nous présentons ici un protocole détaillant la mise en œuvre réussie d&#39;un tel écran préclinique pour maximiser le potentiel de découvertes cliniquement significatives.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Pour maximiser le potentiel pour la découverte de pilotes fonctionnels clés de résistance, sélectionner des clones de cellules isolées d&#39;expansion, tests phénotypiques et le séquençage. Comme illustré sur la figure 4A, les cellules HCT116 traitées de pendant une période prolongée avec le composé cytotoxique n ° 1 conduit à l&#39;émergence spontanée de clones résistants qui a continué de croître au cours du traitement (cercles noirs pointillés). Ces clones ont été prélevés en utilisant l&#39;approche n ° 1 mis en évidence dans la figure 3 et par la suite étendu pour l&#39;analyse phénotypique. Comme représenté sur la figure 4B, les clones résistants 1-3 ont montré une résistance significative au composé n ° 1 et sa proximité analogique composé n ° 2 (une plus grande viabilité / croissance), tandis que tous les clones présentaient une sensibilité à velcade composé cytotoxique non lié. Suite à la confirmation de la résistance phénotypique, ADNg a été isolé et soumis à une analyse de séquençage exome. Des outils de bioinformatique ont été appliquées pour réduire ces variantes dans le structurelles quisont 1) récurrente et 2) ont le potentiel pour un impact fonctionnel (figure 5A). Variantes structurelles qui répondent à ces deux critères ont été confirmés par séquençage d&#39;un outil indépendant. Comme illustré sur la Figure 5B, une mutation faux-sens qui a été hétérozygote identifié en utilisant l&#39;ensemble du séquençage exome été confirmée en utilisant la méthode de séquençage de Sanger (panneau supérieur, la séquence WT; panneau inférieur, séquence mutante). Après confirmation de la séquence, la lignée cellulaire parentale utilisée à l&#39;origine pour l&#39;essai de résistance a été génétiquement modifiée pour exprimer l&#39;ADNc mutant fonctionnellement à confirmer le rôle de la mutation. Comme illustré sur la figure 6, tandis que la surexpression de l&#39;ADNc de WT n&#39;a pas réussi à conférer une résistance, forcé expression de l&#39;ADNc mutant de façon significative la résistance phénotypique conféré au composé n ° 1, ce qui confirme le rôle fonctionnel de cette variation de structure en tant que conducteur de la résistance. Tous les réactifs utilisés pour cette expérience sont présentés dans le tableau 1 </s<html> trong&gt;. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Figure 1. Disposition des plaques d&#39;essai et de contrôle. Teinte bleue, puits de traitement composés. Abat-jour blanc, que du milieu. Les composés sont dilués en série 1: 4 et sont administrés en triple (BD ou EG). 2 composés peuvent être appliqués par plaque. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> Figure 2. courbes de viabilité représentatifs. Ligne pointillée rouge représente l&#39;axe de x jours 0 lecture. Indique des doses croissantes du composé vers la droite et l&#39;axe des ordonnées représente la viabilité par rapport aux puits de contrôle DMSO. 100 GI = dose utilisée pour parvenir à une inhibition de croissance de 100%; GI 50 = dose utilisée pour réduire la viabilité à 50% de contrôle DMSO. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Deux approches pour la cueillette des clones résistants à l&#39;expansion. Approchez 1- utilisation pipette à ramasser et de transfert des clones bien définies à des plaques à 48 puits. Approche 2- utilisation trypsine trempé disques de clonage pour lever clones et transfert à des plaques à 48 puits. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> Figure 4. Confirmation de la résistance pour des clones obtenus HCT116 au composé n ° 1 in vitro. (A) Composé n ° 1 HCT116 clones résistants est apparu suite à la sélection continue de trois semaines. (B) La viabilité des clones résistants et de contrôle a été testée après 72 h de traitement avec divers composés. Composé # 2 est un analogue proche du composé n ° 1. Velcade a été utilisé comme agent de contrôle de la cytotoxique. Les données sont présentées comme moyenne + écart-type de trois répétitions biologiques. Figure 5. IDENTIFICATION DES, une unique mutation récurrente (variantes d&#39;un seul nucléotide, SNVs) dans le gène A dans le composé n ° 1 résistantes clones HCT116. Flux (A) de travail pour identifier SNVs présents dans tous les clones résistants et devrait avoir un impact fonctionnel haute par MutationAssessor. (B) La confirmation de la mutation dans le gène A par Sanger séquençage. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Figure 6. Re-expression de gène muté Une résistance conférée au composé n ° 1 in vitro. La viabilité des lignées de cellules HCT116 modifiées a été testée après 72 h de traitement avec le composé n ° 1. Lignées de cellules mutantes HCT116-WT ou expriment de façon stable WT ou des ADNc mutants du gène A, respectivement. Les données sont présentées comme moyenne + écart type of trois répétitions biologiques. <table><tbody><tr><td> Nom Sample </td><td> Acide aminé </td><td colspan="2"> Tissu primaire </td><td> Zygosité </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> col de l&#39;utérus </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> col de l&#39;utérus </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> la peau </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> * 2 p.Q130fs </td><td colspan="2"> ovaire </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> ovaire </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> Sein </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> p.? </td><td colspan="2"> la prostate </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> p.? </td><td colspan="2"> gros intestin </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> gros intestin </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> endomètre </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> endomètre </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr></tbody></table> Tableau 1. MSH2 cellulaires -mutated Lines. La lignée cellulaire (nom de l&#39;échantillon), la substitution d&#39;acide aminé, la lignée d&#39;origine et le zygotie sont indiqués. <table><tbody><tr><td> Nom Sample </td><td> Acide aminé </td><td colspan="2"> Tissu primaire </td><td> Zygosité </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> gros intestin </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> p.? </td&gt; <td colspan="2"> la prostate </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> gros intestin </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> ovaire </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> estomac </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> p.? </td><td colspan="2"> la peau </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> REH </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homozygote </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> ovaire </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> gros intestin </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> SNU-1 746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> gros intestin </td><td> Homozygote </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> pancréas </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pancréas </td><td> Hétérozygote </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pancréas </td><td> Hétérozygote </td></tr></tbody></table> Tableau 2. MLH1 cellulaires -mutated Lines. La lignée cellulaire (nom de l&#39;échantillon), la substitution d&#39;acide aminé, la lignée d&#39;origine et le zygotie sont indiqués.

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Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

La résistance aux médicaments à thérapies ciblées est très répandue et la nécessité d&#39;identifier les mécanismes de résistance - avant ou après l&#39;apparition des symptômes - est essentiel pour guider les stratégies alternatives de gestion clinique. Ici, nous présentons un protocole de coupler dérivation de lignées résistantes aux médicaments in vitro avec le séquençage d&#39;accélérer la découverte de ces mécanismes.

Implémentation de<em&gt; In Vitro</em&gt; Résistance au médicament Essais: Maximiser le potentiel pour découvrir cliniquement importants mécanismes de résistance

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Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

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