Name: implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00
Duration: 8 min 46 s
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The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. 관심의 화합물 (들)에 대한 GI (50) 평가 <ol><li> 적절한 시드 밀도를 평가하는 관심 세포주에 대한 성장 곡선 (들)을 생성한다. 시딩 다음의 다양한 시점에서의 세포 수를 플롯 (일 2, 4, 6, 8) 일 0에 대하여 처리 대상의 세포주의 상대적인 성장 속도를 제공하는 것이며, 그러한 초기 접종 농도를 평가하기 위해 사용되어야 합류는 7 일 이내에 96 웰 플레이트에 도달하지 않습니다. </li><li> 성장 곡선이 결정되고 나면, 세포 배지 100 ㎕에 불투명, 클리어 바닥 96 웰 플레이트에있는 세포의 수가 적절한 시드 GI (50)을 평가한다. 사용 및 1.1에서 결정된 세포주에 기초하여 세포의 수를 시드. 일반적으로 24 시간 ~의 배가 시간, 예., HCT116과 빠르게 성장하는 세포 라인에 대한 씨앗 3 × 3 셀. <ol><li> 분석 플레이트 (일-1)을 준비합니다. 분석 플레이트를 들어, 문화 미디어 I 100 ㎕에 원하는 농도에 씨앗 세포N 파란색 음영 우물 (그림 1). 웰스 흰색으로 강조은 미디어가 포함되어 있습니다. </li><li> 제어 플레이트 (1 일)을 준비한다. 제어 플레이트, 별도의 96- 웰 플레이트에서 배양 배지 100 ㎕의 단계 1.2.1에서와 같이 셀의 동일한 밀도를 시드. 화합물의 세포 증식 억제 / 세포 독성 특성을 해석하는데 도움이 될 것입니다이 &#39;일 0&#39;읽기 (그림 2) 분석된다. </li></ol></li><li> 다음날 (0 일), 제어 플레이트를 읽었다. RT로 발광 세포 생존 시약 (제조자의 지시에 따라 버퍼와 혼합 cellTiter - 글로 기판)과 평형 균질 용액을 얻었다 내용을 반전시켜 부드럽게 혼합한다. 세포 / 미디어 믹스 100 μL에 시약의 80 μl를 추가하고 세포 용해를 유도하기 위해 30 분 동안 내용을 흔들어. <ol><li> 560 나노 미터의 0.1 ~ 1.0 초 검출 파장의 노출로 설정 루미와 녹음 발광. </li></ol></li><li> (화합물을 시험 화합물을 추가관심) 판 (0 일)을 분석합니다. (10) 농도의 총 200X 최종 농도에서 DMSO의 화합물의 4 시리얼 희석 (화합물 및 하나의 DMSO, 화합물 플레이트를 포함하는 9 희석) : 1을 확인합니다. 초기 시작 지점으로, 0.03 μM의 200 배 낮은 용량 2,000 μM의 최고 용량 (최종 부피 200 μL)을 목표로. </li><li> 10 배 최종 농도 (최종 부피 100 μL, 중간 판)에서 화합물 매체 믹스를 만들기 위해 중간에 희석 한 화합물을 추가합니다. 분석의 3 일에 사용하기 위해 -20 ° C에서 복합 플레이트를 저장합니다. 최고 용량은 10 μm의 (예. 행 B, C 및 D, 0 일) (그림 1)이되도록 삼중의 셀에 화합물 매체 믹스의 10 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 3 일간 분석 번호판을 품어. 사용 후 중간 판 (들)을 폐기하십시오. </li><li> 3 일에, 1.4에서 제조 한 화합물을 사용하여 플레이트 400 μL 1X 화합물 매체 믹스를 준비한다. 미디어를 제거하고 자동 건조 팻 분석 플레이트 전환claved 종이 수건 2 ~ 3 배는 잔여 용지를 제거합니다. 파란색 음영 우물 화합물 / 미디어 (/ 잘 100 μL)를 추가하고 우물이 증발 (그림 1)를 방지하기 위해 경계 미디어 100 μl를 추가합니다. 추가로 3 일간 37 ℃에서 분석 플레이트를 다시 배양. </li><li> 일 6, 단계 1.3에 기재된 바와 같이, 발광을 수행함으로써 판독 가능한 세포의 상대적인 수를 평가한다. </li><li> 화합물의 정적 / 독성 특성을 평가하기 위해 일 0 독서를 사용합니다. 세포 증식 억제 에이전트가 세포주기 정지를 유도하는 반면 독성 에이전트는 세포 사멸을 유도한다. 화합물은 독성이 경우, GI (50), 및 GI에게 저항 분석 50 × 5 농도를 선택하십시오 (6 일 독서는 일 0 읽기 아래). 화합물 정체 (D0 판독 이상인)를 유도하는 경우에는, GI (100) 및 저항 (100) 분석을위한 GI X5 (도 2)를 고려한다. </li></ol> 2. 약물 저항 시험 법 설정 <ol><li> 작업 재치 경우HA 세포 증식 제, 저항 분석 150 ㎜ × 2 조직 배양 접시 (부피 = 30 ml) 중 30 ~ 40 %가 합류 시드 세포. 독성 에이전트와 함께 작업하는 경우, 70-80 %의 합류에 씨앗. </li><li> 그대로 불일치 수리 (MMR) 메커니즘을 항구 세포주를 들어, 단계에서 세포를 배양 발암 물질 N- 에틸 -N- 니트로 소 우레아와 37 ° C (ENU)에서 2.1 O / N. 게놈 불안정성을 향상시키기 위해 50 ㎎ / ㎖ ENU (최종 농도를 50㎍ / ㎖)의 스톡 용액을 30 μL로 세포를 처리한다. 결함 MMR (표 2 및 3), 또는 다른 발암 ENU 치료가 필요하지 않을 수있는 세포주. <ol><li> 다른 세포주를 들어,의 microsatellite 불안정 (12)를 사용하여 NCI 기준에 의해 MMR 결핍을 결정, 또는의 microsatellite 불안정 분석 또는 MMR 유전자 13-15의 에피 지노믹스 / 게놈 프로파일 링을 사용하여 게시 된 특성을 기반으로. </li></ol></li><li> 시험 화합물 (들)과 함께 취급 세포농도에 관심이 단계 1.8에서 결정. 전형적인 세 가지 일 생존 분석 (10)에 세포의 죽음의 원인이 독성이 강한 화합물의 경우 (즉, GI 50) 저용량 치료를 시작하고 점진적으로 강력한까지 농도를 화합물 (GI 50의 배수)를 모든 2~3주 증가 저항이 관찰된다. 미디어를 보충하고 모든 3 일을 복잡하게. </li><li> 선택이 시작되면 내성 클론이 등장 할 때까지, 변경 미디어 / 화합물은 3-4 일마다 섞는다. 처리 된 세포는 DMSO 처리 된 대조군 세포의 급성 치료에 대해 약물 치료 기간 동안 큰 성장 / 생존 능력을 보여줄 때 정의에 의해 저항이 나온다. </li></ol> 3. 단일 세포 클론을 격리를 <ol><li> 세포의 생존 클러스터에 위상차 현미경 (배율 40 배)를 사용하여 배양 접시를 검사합니다. </li><li> 마킹 펜 접시의 하단에 표시 만족 클론. 평균 크기의 클론 (큰 식민지를 선택 할 수있다여러 세포에서 발생) 및 다른 식민지에서입니다. 단계 3.3에서 설명한 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 복제를 선택합니다. </li><li> 접근 1 : 피펫을 사용하여 (그림 3) <ol><li> 성장 미디어를 제거하고 부동 세포를 제거하는 1X PBS로 씻어. </li><li> 피펫 팁과 &#39;따기&#39;클론에 가이드로 블랙 마크를 사용 (피펫에 부착 P200 바람직). </li><li> 200 μL 신선한 미디어 48 웰 플레이트에 전송 클론 (반 화합물 농도는 세포의 최적의 복구 할 수 있도록). </li><li> 세포는 200 μL 신선한 미디어 / 이상적인 화합물 농도를 추가하기 전에 2-3 일 동안은 복구 할 수 있습니다. </li><li> 3-4 일마다 미디어 / 화합물을 변경하고 클론을 확장하기 위해 계속합니다. </li></ol></li><li> 접근법 2 : 복제 디스크를 사용하여 (그림 3) <ol><li> 단계 3.2에 설명 된대로 클론을 표시합니다. </li><li> 5 ㎖의 0.25 % (T)를 포함하는 10cm 조직 배양 접시에 3mm 복제 디스크를 놓고2 분 rypsin-EDTA. </li><li> 접시에서 대기음 미디어는 저항하는 클론을 포함하고 멸균 일회용 집게를 사용 트립신 배어 복제 디스크와 클론을 오버레이. </li><li> 클론은 37 ° C 배양기에서, 판을 들어 올립니다 얼마나 쉽게에 따라 1-2 분 동안 둡니다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 복제 디스크를 선택하고 200 μL 신선한 미디어와 화합물의 절반 농도로 48 웰 플레이트에 전송합니다. </li><li> 피펫은 위아래로 부드럽게 복제 디스크에서 셀을 제거하고 37 ° C (우물에 디스크를 복제두고)에서 O / N을 배양한다. </li><li> 다음날 아침, 48 웰 플레이트에서 복제 디스크를 제거하고 200 μL 신선한 미디어 / 화합물 (반 이상적인 화합물 농도)와 우물을 보충. </li><li> 3 일 후 화합물의 이상적인 농도 미디어를 보충. </li><li> 미디어 / 화합물 3-4 일마다 변경하고 클론을 확장하기 위해 계속합니다. </li></ol></li></ol> 4. R의 정도를 평가고립 된 클론의 esistance <ol><li> 10-20 콜로니가 확장되면 저항의 정도를 평가하기위한 단계 1에 기술 된 바와 같이, GI (50) 곡선을 생성한다. </li><li> 항상 선택 과정에서 DMSO로 처리 제어 인구를 포함한다. 그것은 저항의 스펙트럼이 큰 될 것입니다 가능성이 높다 (다른 사람이 전체 저항을 보여주는 반면, 일부는 부분 표시). 두 그룹 사이에 다를 수 있습니다 저항의 메커니즘으로 이러한 각 클래스에서 몇 클론를 수집합니다. </li></ol> 5. 차세대 시퀀싱 <ol><li> 15 ㎖에 2 백만 세포 (제어 및 내성 클론) (5 분 500 XG)를 스핀 다운 gDNA를와 RNA 컬렉션 모두 원뿔 유리 병 (따라서 2 × 2 백만). </li><li> 1X PBS로 두 번 세척하고 분리를위한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 펠렛을 동결. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 또는 gDNA를 격리하는 상용 추출 키트를 사용합니다. </li><li> 차세대 시퀀싱에 대한 샘플 제출공급 업체의 프로토콜 10을 사용. </li></ol> 6. 생물 정보학의 샘플 분석 (전체 엑솜 시퀀싱) <ol><li> 전처리는 가장 좋은 방법은 DNA를-서열 파이프 라인 (16)에 따라 데이터를 시퀀스. <ol><li> 모든 광대역 무선 접속 (17) 사용 인간 게놈 GRCh37를 참조 읽는지도. Samtools (18)로 압축 BAM 형식으로 압축되지 않은 SAM 형식의 정렬을 변환합니다. 정렬 정렬에 의해 Samtools와 좌표입니다. 피카를 사용하여 읽기 그룹을 추가합니다. (특정 BWA, Samtools 및 피카 명령 들어, 선 1-4을 보충 텍스트 1 참조) </li><li> 마크 모든 중복 피카 도구 19 세트에서 MarkDuplicates 명령을 사용하여 읽습니다. 지수 Samtools이 파일. (보충 텍스트 1, 라인 5-6) </li><li> 모든 읽기에 걸쳐 일치하지 않는 기지를 최소화하기 위해, 다시 정렬은 INDEL의 재정렬 (20)를 사용하여 작은 삽입 또는 삭제를 은닉 지역에 로컬로 읽습니다. (보충 텍스트 1, 라인 7-8) </li><li> 더 accurac을 개선하기 위해변형 통화, 기본 품질 점수 재 교정 도구를 사용하여 경험적으로 재조정 기본 품질 평가 점수의 Y. 기본 품질을 교정 도구는 정확한 초기 품질 평가 점수뿐만 아니라, 읽기 그룹, 기계주기, 기본 위치 및 디 뉴클레오티드 컨텍스트 (+ 이전 현재 기지) 등 여러 가지 기능의 계정 공분산으로해야뿐만 아닙니다. 피카드의 PrintReads와 재 교정 BAM를 생성합니다. (이 단계의 특정 명령에 대해, 라인 9-10 보충 텍스트 1 참조) </li><li> 단계를 반복 6.1.1 염기 서열을 각 샘플에 대한 (보충 텍스트 1, 라인 1-10) 6.1.4을 통해. </li></ol></li><li> 쌍을 이루는 변형, 21-23을 tool19 호출하여 각 클론의 단일 염기 변이 (SNV)를 확인합니다. 각 클론 서열를 들어, 실행 한 쌍의 변형은 일치하는 &quot;정상&quot;으로 부모의 복제를 사용하여 호출. (보충 텍스트 1, 11 행) </li><li> 재발 성, 고품질의 변형을 필터링 및 변형 애노테이션 도구 (24)와 주석을 준비. 버지니아 Deprioritize모든 저항하는 클론을하지 공통 riants. (보충 텍스트 2에서 R 스크립트를 참조하십시오) </li><li> 주석 도구 (25), (26)와 변형을 주석. 많은 변형 주석 도구는 데이터 업로드 및 원격 서버에 의해 처리 될 수 있도록 첨부 된 웹 응용 프로그램이 있습니다. </li><li> 고 기능성 영향을의 예측 그 변종의 우선 순위를 기능에 미치는 영향 예측 도구 27 ~ 29을 사용합니다. 변형 주석과 마찬가지로, 몇 가지 도구는 웹 인터페이스를 통해 기능에 미치는 영향 예측에 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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이 기사에 대한 출판 비용은 H3 생물 의학에 의해 지급됩니다.

세포주 (들)의 선택 : 유전 적 상태와 게놈 불안정성의 특성 의심 할 여지없이 성공적으로 임상 적으로 관련된 저항 메커니즘을 밝혀에서 가장 중요한 요소는 초기 셀 라인 선택이다. 두 가지 요소가 고려되어야한다. 첫째, 질병의 정의 유전 적 특성을 품고 같은 혈통 / 하위 유형의 세포 라인 (들)을 선택하는 것을 목표로 (예., 흑색 종에서 BRAF V600E). 표시 (33, 34)의 양쪽 다양한 세포주 및 일차 30-32 / 전이 종양 공개적 사용할 transcriptomic 돌연변이 데이터 질의는 선택 프로세스를 용이하게한다. 임상 적으로 중요한 유전 적 변형을 가진 세포주의 식별이 이상적이지만, 경우에 따라서 이는 이러한 스크리닝 프로세스의 난이도 및 길이 등의 요인으로 인해 가능한 세포주의 부족 또는 실현하는 것이 가능하지 않을 수도있다. 35 가속화 될 수 있다는 희망 DNA MMR 기법의 빠른 성장 동역학 및 결실로 이용 될 수있다. COSMIC 데이터베이스에 기초하여, 여러 후보 세포주 두 자주 돌연변이 MMR 유전자, MSH2 MLH1 또는 결핍 중 하나에 존재한다 (표 2 및 3). 관심 세포주는 알킬화제로서 MMR, 물리적 또는 DNA 반응성 화학적 돌연변이 유발 급성 치료 베어링 결함이 존재하지 않는 경우 또는, N - 에틸 - N의 -nitrosourea (ENU)는 게놈의 불안정성을 개선 할 수있다. 비록 수도 크게이야 두 가지 방법내성 클론을 획득 및 추적을 시퀀싱하는 시간을 호르 텐, 엄격한 기능 테스트는 비 기능의 더 큰 수와 후보 유전자에서 수행해야 승객 돌연변이 출현 할 가능성이있다. SNVs 기능적으로 관련된 돌연변이를 식별 가능성을 최대화하기 위해 순위가 될 수있다. 첫째, 선택은 독립적 인 클론에 재발되어 그 돌연변이는 이러한 돌연변이가 저항의 드라이버입니다 가능성을 높일 것입니다. 이벤트 재발 돌연변이 약물의 작용 메커니즘에 초점을 맞춰 SNVs, 식별되지 않은 (예를 들면, 약물 또는 약물 표적 대상물의 공지 하류 이펙터) 의미가있을 수있다. 궁극적으로, 황금 표준은 항상 약물에 민감한 부모의 세포에서 자궁외의 cDNA 발현에 의해 후보 SNVs의 저항 부여 활동의 실험적인 평가입니다. RNA 서열 대 DNA 일단 내성 클론을 생성하는 DNA 및 / 또는 RNA되었습니다필요에 따라 순서가 될 수있다. DNA 염기 서열, 엑솜 또는 전체 게놈의 염기 서열 중 하나는, 이러한 SNP를, 삽입과 삭제 등의 생식 세포와 체세포 변이의 식별을 허용하고 번호가 변형 복사합니다. 생성 알려진 코딩 영역에서 읽고에 더 많은 비용 친화적 인 엑솜 시퀀싱이 초점을 맞추고있는 반면, 전체 게놈 시퀀싱은 증강 또는 miRNA가 36 비 코딩 요소의 돌연변이의 식별을 용이하게 할 수는 전체 게놈 염기 서열 데이터를 생성합니다. 유전자 발현 데이터는 DNA 시퀀싱 동안 계측되지 않으므로, 어떤 돌연변이 (들)의 기능 드라이버 될 가능성을 예측하는 것이 곤란하다. 이와 관련, RNA의 염기 서열, 비록 비용이 많이 드는,이 장점을 제공합니다. 돌연변이 호출에서만 발현 RNA 종에서 수행된다는 사실은 관심의 돌연변이는 기능적 드라이버 일 수있는 가능성을 향상시킨다. 후속 기능 테스트, 또한 RNA 시퀀싱 돌연변이 더 집중 조사를 허용 이외에또한 저항과 같은 강력한 드라이버 역할을 할 수있다 유전자 융합을 포함하여 유전자 발현의 변화, 대체 접합 및 새로운 키메라 RNA 종을 식별 할 수있는 장점을 제공합니다. 생물 정보학 파이프 라인 예 명령을 예시하기위한 것이며, 그러나 더 자세한 설명서와 자습서 연구소 16 넓은에서 사용할 수 있으며, NGS 분석을 시작하기 전에 반드시 숙지해야한다. 다음 명령은 모든 도구와 참조 데이터가 사전 설치되어있는 시스템에서 UNIX 쉘 환경을 위해 설계되었습니다. 이 명령은 또한 FASTQ 파일을 포함하는 한 쌍의 엔드 시퀀스는 &quot;부모&quot;와 &quot;저항&quot;공급 업체로부터 수신 &quot;데이터&quot;디렉토리에 배치 된 이름, 두 샘플에서 읽어 가정합니다. 대부분의 경우, 이들 명령은 적응되어야하거나 추가 명령 줄 인자를 사용하여 특정 애플리케이션에 대해 최적화색인 처리 (예를 들면, 광대역 무선 접속 명령에 &quot;-t 8&quot;을 추가하면 8 개의 CPU 코어를 통해 다중 스레드 작업을 할 수 있습니다). BAM 파일 당 하나의 샘플은 특정 툴에 대한 파일 포맷 요구 사항을 준수하기 위하여,이 경우에도 (생물학적 시료에 정렬을 할당) 판독 기는 종종 BAM 파일에 추가되어야한다. 그룹 매개 변수 RGID, RGSM, RGPL, RGPU을 읽고 RGLB 임의의 샘플 이름을 설명하는 문자열, 시퀀싱 플랫폼 및 라이브러리 전략이 될 수 있습니다. 생체 분석 대 체외에서 체외 선택에 의해 식별 여러 저항 메커니즘 임상 관련성이 확인되었지만, 메커니즘 임상 저항의 관련성 또는 주된 메카니즘을 제공하지 않을 수 있다는 가능성이 존재한다. 그 이유 중 하나는 치료에 저항 구동의 미세 환경의 중요한 역할, 실험 프로토콜 / D에 설치 결여 성분을 포함 할 수있다지금까지 iscussed. 실제로, 몇몇 연구는 종양 세포가 기질 37,38 의해 부여 저항 타고난 메커니즘을 의미 기질 세포의 존재하에 배양 된 경우 종양 세포를 죽일 수있는 항암제 비효율적 렌더링되는 것을 보여 주었다. 이러한 기질에 의한 인수 저항 메커니즘을 식별하기 위해, 하나는 시험 관내 공동 문화 또는 생체 내 종양 저항 분석법을 수행하는 것이 좋습니다 수 있습니다. 전자의 분석이 매우 복잡하기 때문에, 많은 저항 구동의 기질의 잠재적 역할을 해결하기 위해 약물 내성 종양 이종 이식을 발생에 의존하고있다. 이러한 연구는 기질 실제로 후자의 역할을 할 수 있음을 암시 체외 선택에 대한 저항성에 대하여 모두 동일한 5 및 39 독특한 메커니즘을 밝혀냈다. 그러나, 하나는 이러한 내성 종양을 생성하기 위해 취할 수있는 시간과 후속 게놈 분석-complexitie의 복잡성 염두해야인트라 종양 분자 세포 이질성으로 인해 S. 대상 식별 약물 내성 메카니즘 잠복 외에도이 NGS 기반 게놈 프로파일 링 방법은 또한 화학 프로브의 표적 세포를 식별하기 위해 적용 할 수있다. 역사적으로, 복수의 바이어스 방법은 정량적 프로테오믹스 결합 친 화성 정제, 효모 게놈 방법, RNAi의 선별 및 계산 추론 40 접근법을 포함한 생물학적 활성을 가진 저 분자량의 화학 물질의 세포 작용 메커니즘과 목표물을 식별하기 위해 사용되어왔다. 화합물의 기능 세포의 목표에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 저항을 사용 표현형 내성 세포 인구, 고유의 재발 단일 염기 변이 (SNVs) 또는 발현 변화의 식별 NGS 기반 게놈 또는 transcriptomic 프로파일을 사용하여 약제 내성 메커니즘의 해명에 대한 확장으로. 티그의 관찰 저항 메커니즘 서브셋 소분자의 직접 표적 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 재발 수반 할 수 있다는 생각에 기초한다. 최근, 몇몇보고 특히 9,10 프로빙 소분자의 세포를 대상으로 드러내는, 대규모 암 세포주 감도 프로파일 링을 포함하여 다른 방식으로 조합함으로써, 방법의 유용성을 확인.

강력한 시퀀싱 기술과 향상된 데이터 분석 도구에 의한 종양 게놈의 상세한 분자 특성은 특정 암 유형 1, 2의 주요 유전 적 변화를 발견하게되었다. 이러한 HER2, BCR-ABL, EGFR과 ALK 이러한 유전 적 병변을 목표로 표적으로 한 치료의 개발은 크게 환자의 1, 2의 삶의 질을 향상되었습니다. 저항 궁극적 나온다 그러나, 이러한 접근법의 특이성에도 불구하고, 대부분의 단일 요법에 대한 임상 적 반응은 차선왔다. 최근에 상당한 진전이 표적 치료제에 대한 내성의 분자 토대 이해에서했다. 흥미롭게도, 그것은 저항의 눈에 잘 띄는 메커니즘이 지속적으로 목표 / 경로의 활동을 포함하는 것이 분명 해지고있다. 점의 경우로, 안드로겐 수용체 (AR)은 전립선 암의 enzalutamide 치료, AR 자체의 돌연변이를 활성화 유지의 농축에 이르게 -directed AR-신호 OUTP3-5 억제제의 존재 하에서 UT. 이 지식에 WT 및 돌연변이 AR 기능을 모두 억제을 계속할 수 있습니다 제 3 세대 길항제를 개발) 1 공격적인 캠페인을 주도하고있다 enzalutamide 방지 PCA 3, 2) 치료 적 개입의 대상이 될 수있다 AR 신호의 잠재적 인 다운 스트림 노드를 식별 . 마찬가지로, EGFR, BRAF 및 ABL을 대상으로 그 억제제의 다른 클래스에 대한 저항은 종종 원래의 중독성 키나제 경로 (1)를 활성화 돌연변이로 이어집니다. 저항은 필연적으로 대부분의 환자에서 출현하는 지식, 방법을 개발하는 것은 신속하게 효과적인 후속 치료의 개발을 허용합니다 빛에 이러한 메커니즘을 가지고있다. 널리 사용되는 한 가지 방법은 D 의무가 될 수있다 유전 적 병변에서 부화 / 고갈를 식별하기 위해 상대적으로 치료 순진 또는 민감한 종양에 대한 임상 난치성 종양의 게놈을 분석하는 것입니다양탄자 발견. 약속에도 불구하고, 빠른 검색을 방해이 방법의 두 가지 책임이 있습니다. 첫째, 게놈 심문에 대한 종양 물질에 적시에 액세스를 얻는 것은 치료 요법에서 이동에 큰 장애물이 될 수있다. 종양이 중요한 내 종양 이질성 6,7를 제공 할 수 있기 때문에 두 번째로, 저항 설정에서 유전 적 병변의 무수한의 디컨 볼 루션 도전 할 수있다. 이러한 문제의 관점에서, 저항 메커니즘의 임상 발견에 대한 의존도가 증가되었습니다. 이 방법은 이전의 저항의 발병 다음 이러한 메커니즘 중 하나 이전에 치료 또는 곰 환자에서 다른 임상 관리 전략을 안내 할 수있는 임상 시험 (1)에 눈에 띄는 저항 메커니즘의 식별을 허용 할 수있다. 널리 사용되는 한 이러한 전임상 검색 도구는 편견 기능의 RNAi 화면을 적용하는 것입니다. 시험을위한PLE, 휘태커와 동료 NF1 손실이 지속 MAPK 경로 활성화 (8)를 통해 영국 공군 및 MEK 억제제에 대한 내성을 매개 것을 식별하기 위해 게놈 규모 RNAi의 화면을 적용했다. NF1의 기능 상실 돌연변이가 RAF 억제 및 활성화 8 vemurafenib 내성 흑색 종 종양에서 본질적 내성 BRAF -mutant 종양 세포에서 관찰 된 이러한 결과는 임상 적으로 중요한 것으로 밝혀졌다. 그러나,이 접근법의 성공에도 불구하고, 많은 임상 적으로 관련된 표적은 종종 추측 때문에이 방식의 기능 상실 바이어스 식별되지 않는다. 반대로, 저항 메커니즘 전임상 발견을위한 덜 바이어스 도구 NGS 기반 게놈 또는 transcriptomic 프로파일과 함께 관심있는 화합물을 장기간 노출을 통해 내성 세포주의 생성을 수반한다. 이 접근법은 성공적 자발 식별 몇몇 그룹에 의해 구현 된저항 5,9,10 수 있도록 재발 단일 염기 변형 또는 식 변경. 예를 들어, AR의 재발 F876L 돌연변이는 최근 체외 3-5에 저항하는 클론과 병원 4 이전에이 돌연변이의 식별에 생체 5 이종 이식 종양에서 발견되었다. 아주 최근에, Bhang와 동료 대부분의 기능 관련 돌연변이를 제안 기존의 모집단의 일부 장기간 약물 노출시 발생하는 저항하는 클론의 대부분을 보여주기 위해 두 개의 임상 적 모델 ClonTracer을 사용 (2015) (11)는 사전에 기존의 이미 가능성 즉 선택 (11) 중 선택이된다. 앞서 논의 종양 게놈 프로파일과는 대조적으로, 이하에서 이질성이 방법의 이점은 &quot;균질&quot;내성 클론 전위 드라이버보다 정확한 유전 절개를 용이 분석에 사용 된 바와 같다. Furtherm철광석은 호쾌 저항의 메커니즘을 밝혀위한 전위에 더하여,이 방법은이 정보를 알 수 10되는 생체 활성 작은 분자의 세포 작용 메커니즘과 목표물을 식별하기 위해 적용될 수있다. 명확한 장점과이 방법의 여러 용도로 주어진, 우리가 임상 적으로 의미 발견 가능성을 최대화하기 위해 이러한 전임상 화면의 성공적인 구현을 자세하게 프로토콜을 제시한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

저항의 핵심 기능 드라이버를 발견하기위한 잠재력을 극대화하기 위해, 확장, 표현형 테스트 및 시퀀싱을위한 단일 세포 클론을 선택합니다. 도 4a에 도시 된 바와 같이, HCT116 세포 치료 (점선 흑색 동그라미) 동안 계속 성장 내성 클론의 자발적인 출현되었다 세포 독성 화합물 # 1과 장기간 치료. 이 클론 (1) 그림 3에서 강조하고 이후 표현형 분석을 위해 확장 된 접근 방식 #을 사용 고른했다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 모든 클론이 비 관련 세포 독성 화합물 벨케이드에 민감도를 보였다 반면, 저항성 클론 1-3 모두 # 1, 화합물 상당한 내성을 보여 긴밀한 아날로그 화합물 # 2 (더 생존 / 성장). 표현형 저항의 확인 후, gDNA를 격리하고, 전체 엑솜 시퀀싱 분석을 위해 제출했다. 생물 정보학 도구는 그 구조 변형에에 좁힐 적용되었는지1) 재발 성이고 ​​2) 기능적 영향 (도 5a)에 대한 가능성을 갖는다. 이 두 가지 기준을 충족 구조 변형은 독립적 인 시퀀싱 툴에 의해 확인되었다. 도 5b, 전체 엑솜 시퀀싱은 생거 시퀀싱 방법을 사용하여 확인 하였다 동정 이형 과오 돌연변이에 나타낸 바와 같이 (상부 패널, WT 시퀀스 저급 패널 돌연변이 서열). 서열 확인 후, 원래 저항 검사에 사용 된 부모 세포주 돌연변이의 기능적 역할을 확인하기 돌연변이의 cDNA를 발현하도록 유전자 조작했다. 도 6에 도시 된 바와 같이 WT cDNA를 과발현 내성을 부여하지 못한 반면에 저항의 드라이버로서이 구조적 변이의 기능적 역할을 확인하고, # 1, 화합물 변이체 cDNA를 크게 부여 표현형 적 내성의 발현을 강제. 이 실험에 사용 된 모든 시약은 표 1에 요약되어 </s<html> trong&gt;. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> 분석 및 제어 판 1. 레이아웃 그림. 푸른 그늘, 화합물 처리 우물. 흰 그늘에만 매체. 화합물은 직렬 1을 희석 : 4, 삼중 (BD 또는 EG)에서 관리됩니다. (2) 화합물은 플레이트 당 적용될 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> 2. 대표적인 생존 곡선을 그림. 붉은 점선은 0 일 독서. X 축은 오른쪽 및 Y 축에 화합물의 투여 량 증가를 나타내는 DMSO의 대조군 웰에 대해 생존을 나타냄. GI 100 % 성장 억제를 달성하는 데 사용 용량 = 100; GI DMSO 제어의 50 % 생존율을 감소 시키는데 사용될 선량 = 50. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. 확장을 위해 저항하는 클론을 따기위한 두 가지 방법. 접근 1 사용 피펫 픽업 및 48 웰 플레이트에 잘 정의 된 클론을 전송합니다. 접근 방법 2를 사용 클론을 들어 올려 48 웰 플레이트에 전송하는 복제 디스크를 트립신은 젖은. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> 시험관 내에서 # 1, 화합물 HCT116 클론 달성 저항도 4 확인. (A) 화합물 # 1 HCT116 내성 클론은 연속 3 주간 선택 다음 나타났다. 제어 및 내성 클론의 (B)의 생존은 다양한 화합물과 72 시간 처리 후 시험 하였다. 복합 # 2는 화합물 # 1의 가까운 아날로그입니다. 벨케이드는 제어 세포 독성 제로서 사용 하였다. 데이터는 세 가지 생물 복제의 평균 + 표준 편차로 표시됩니다. 화합물 # 1 내성 HCT116 클론의 유전자에 고유 한, 재발 돌연변이의 그림 5. 확인 (단일 염기 변형, SNVs). (A) 작업 흐름이 모든 내성 클론에 존재 SNVs를 확인하고 고 기능성 영향을 미칠 것으로 예상합니다 MutationAssessor에 의해. 생거 시퀀싱에 의해 유전자의 돌연변이 (B) 확인. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> 돌연변이 유전자 부여 저항도 6 재 발현은 시험 관내에서 # 1는 화합물. 설계 HCT116 세포주의 생존이 화합물 1과 72 시간 처리 후에 시험 하였다. HCT116-WT 또는 돌연변이 세포주는 안정적으로 각각, WT 또는 유전자의 돌연변이 된 cDNA를 발현한다. 데이터는 평균 + 표준 편차 O로 표시됩니다세 생물학적 복제 F. <table><tbody><tr><td> 샘플 이름 </td><td> 아미노산 </td><td colspan="2"> 기본 조직 </td><td> Zygosity </td></tr><tr><td> C-33- </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> 경부 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> C-33- </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> 경부 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> 피부 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> 난소 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> 난소 </td><td> 이형 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> 유방 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> 된 LNCaP </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> 전립선 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> 대장 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> 대장 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> SKUT-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> 자궁 내막 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> SKUT-1B </td><td> PL787fs * 11 </td><td colspan="2"> 자궁 내막 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr></tbody></table> 표 1. MSH2 -mutated 세포주. 셀 라인 (샘플 이름), 아미노산 치환은, 기원의 혈통과 zygosity가 표시됩니다. <table><tbody><tr><td> 샘플 이름 </td><td> 아미노산 </td><td colspan="2"> 기본 조직 </td><td> Zygosity </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> 대장 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> 피.? </TD&gt; <td colspan="2"> 전립선 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> 대장 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> 난소 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> 위 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> PR-멜 </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> 피부 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> REH </td><td> 피.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </TD&gt; <td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> 난소 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> 대장 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> 대장 </td><td> 동형 접합 </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> 이자 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> 이자 </td><td> 이형 </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> 이자 </td><td> 이형 </td></tr></tbody></table> 표 2. MLH1 -mutated 세포주. 셀 라인 (샘플 이름), 아미노산 치환은, 기원의 혈통과 zygosity가 표시됩니다.

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Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

압력 Myography를 사용하여 저항 장간막 동맥에서 근육 조직 대응 및 Vasoactivity 평가

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

연구

의학

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

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