Name: implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00
Duration: 8 min 46 s
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The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. Evaluación de GI 50 para el compuesto (s) de interés <ol><li> Generar curva (s) de crecimiento para líneas de células de interés para evaluar la densidad de siembra apropiada. PARCELA el número de células en diversos puntos temporales después de la siembra (días 2, 4, 6 y 8) en relación con el día 0. Esto proporcionará una tasa de crecimiento relativo de la línea celular de interés y debe ser utilizado para evaluar la densidad de siembra inicial de tal manera que confluencia no se alcanza en placas de 96 pocillos plazo de 7 días. </li><li> Una vez que las curvas de crecimiento se han determinado, la semilla número apropiado de células en placas no transparentes, fondo claro de 96 pocillos en 100 l de medio celular para evaluar GI 50. Semillas del número de células en función de la línea celular utilizada y determinado en 1.1. Típicamente, la semilla 3x10 3 células de líneas de células de crecimiento rápido con un tiempo de duplicación de ~ 24 horas, por ejemplo., HCT116. <ol><li> Preparar una placa de ensayo (día-1). Para la placa de ensayo, las células de semillas a la densidad deseada en 100 l de i medios de cultivon pozos sombreados en azul (Figura 1). Wells resaltado en blanco contienen solamente los medios de comunicación. </li><li> Preparar una placa de control (día-1). Para la placa de control, la semilla de la misma densidad de las células como en el paso 1.2.1 en 100 l de medio de cultivo en una placa de 96 pocillos separada. Este &quot;día 0&quot; lectura le ayudará en la interpretación de la naturaleza citotóxico / citostático de los compuestos que se analiza (Figura 2). </li></ol></li><li> Al día siguiente (día 0), leer la placa de control. Equilibrar reactivo de la viabilidad celular luminiscente (sustrato CellTiter-Glo mezclado con tampón de acuerdo con las instrucciones del fabricante) a TA y se mezcla suavemente por inversión de contenidos para obtener una solución homogénea. Añadir 80 l de reactivo a los 100 l de células / mezcla de medios y agitar durante 30 min contenidos para inducir la lisis celular. <ol><li> Luminiscencia Grabar con un luminómetro ajustado a una exposición de 0,1 a 1,0 seg y detección de longitud de onda de 560 nm. </li></ol></li><li> Añadir los compuestos de ensayo (compuestosde interés) para analizar las placas (día 0). Hacer una dilución 1: 4 en serie de compuestos en DMSO a 200x concentración final para un total de 10 concentraciones (9 diluciones que contienen el compuesto y sólo uno DMSO, la placa de compuesto). Como un punto de partida inicial, el objetivo de una dosis 200x más bajo de 0,03 M y una dosis superior de 2.000 M (último volumen 200 l). </li><li> Añadir compuestos diluidos en serie a medio hacer una mezcla de compuesto medio a 10 veces la concentración final (último volumen 100 l, placa intermedia). Guarde la placa de compuesto a -20 ° C para su uso en día 3 del ensayo. Añadir 10 l de la mezcla de compuesto de mediano a las células por triplicado tal que la dosis más alta es de 10 micras (por ejemplo., Las filas B, C y D, día 0) (Figura 1). Incubar las placas de ensayo durante 3 días a 37 ° C. Deseche placa intermedia (s) después de su uso. </li><li> El día 3, preparar una mezcla de compuesto 1x a medio 400 l usando las placas de compuesto preparado en 1.4. Invierta placas de ensayo para eliminar los medios de comunicación y seque el automóviltoallas de papel claved 2-3x para eliminar los medios de comunicación residual. Añadir compuesto / media (100 l / pocillo) a los pocillos sombreados en azul y añadir 100 l de medios de comunicación para pozos perímetro para evitar la evaporación (Figura 1). Vuelva a incubar las placas de ensayo a 37 ° C durante 3 días. </li><li> El día 6, evaluar número relativo de células viables mediante la realización de una lectura de luminiscencia como se describe en el paso 1.3. </li><li> Usa el día 0 de lectura para evaluar la naturaleza estática / tóxicos de los compuestos. Los agentes tóxicos inducen apoptosis mientras que los agentes citostáticos inducen la detención del ciclo celular. Si el compuesto es tóxico (día 6 de lectura está por debajo días 0 lectura), considere la posibilidad de elegir GI 50 y GI 50 x 5 concentraciones para los ensayos de resistencia. Sin embargo, si el compuesto induce la estasis (igual o mayor lectura de la d0), considere GI 100 y GI 100 x5 para ensayos de resistencia (Figura 2). </li></ol> 2. La creación de resistencia a los medicamentos ensayos <ol><li> Si el ingenio de trabajoha agente citostático, las células de semillas a una confluencia de 30-40% en 150 mm 2 platos de cultivo de tejidos (volumen = 30 ml) para el ensayo de resistencia. Si se trabaja con un agente tóxico, sembrar en una confluencia del 70-80%. </li><li> Para las líneas de células que albergan un mecanismo intacto desajuste de reparación (MMR), incubar las células desde el paso 2.1 O / N a 37 ° C con el carcinógeno N-etil-N-nitrosourea (ENU). Tratar las células con 30 l de una solución madre de 50 mg / ml ENU (concentración final 50 mg / ml) para mejorar la inestabilidad genómica. Para las líneas celulares que tienen un MMR defectuosos (tablas 2 y 3), el tratamiento con ENU u otros carcinógenos puede no ser necesario. <ol><li> Para otras líneas celulares, determinar MMR-deficiencia por criterios NCI utilizando inestabilidad de microsatélites 12, o en base a la caracterización publicada utilizando ensayos de inestabilidad de microsatélites o perfil genómico / epigenómico de genes MMR 13-15. </li></ol></li><li> Tratar a las células con el compuesto de ensayo (s) deinterés a la concentración determinada en el paso 1.8. Para los compuestos altamente tóxicos que causan la muerte de las células en un típico ensayo de viabilidad de tres días 10, comenzar con un tratamiento de baja dosis (es decir, GI 50) y gradualmente aumentar la concentración (múltiplos de GI 50) de compuesto, cada 2-3 semanas hasta robusta se observa resistencia. Reponer los medios de comunicación y agravar cada 3 d. </li><li> Una vez que la selección se ha iniciado, cambio de medio / compuesto mezclar cada 3-4 días hasta que los clones resistentes emergen. Resistencia por definición surge cuando las células tratadas muestran un mayor crecimiento / viabilidad durante el tratamiento con medicamentos en relación con el tratamiento agudo de las células control tratadas con DMSO. </li></ol> 3. Aislamiento de clones única célula <ol><li> Examine placa de cultivo mediante microscopía de contraste de fase (magnificación 40x) para grupos viables de células. </li><li> Marcar clones satisfactorios en la parte inferior del plato con un marcador. Escoja clones que son de tamaño medio (colonias grandes puedenproceder de varias celdas) y bien aislado de otras colonias. Escoja clones usando uno de dos métodos descritos en el paso 3.3. </li><li> Enfoque 1: Usando una pipeta (Figura 3) <ol><li> Retire el medio de crecimiento y enjuague con PBS 1x para eliminar las células flotantes. </li><li> Utilice marcas negras como guía para &#39;picking&#39; clones con punta de pipeta (que se adjunta a la pipeta, p200 preferentemente). </li><li> Clones de transferencia en placas de 48 pocillos con 200 l medio fresco (con concentración de compuesto medio para permitir la recuperación óptima de las células). </li><li> Permitir que las células se recuperen durante 2-3 días antes de la adición de 200 l de medios de comunicación fresca / concentración compuesto ideal. </li><li> Continuar para cambiar los medios de comunicación / compuesto cada 3-4 días y seguir ampliando clones. </li></ol></li><li> Enfoque 2: El uso de la clonación de discos (Figura 3) <ol><li> Marque clones como se describe en el paso 3.2. </li><li> Coloque los discos de 3 mm de clonación en una placa de cultivo tisular de 10 cm que contiene 5 ml de 0,25% trypsin-EDTA durante 2 min. </li><li> Aspirar los medios de plato que contiene clones resistentes y superponer clones con tripsina empapado discos de clonación utilizando unas pinzas estériles desechables. </li><li> Dejar durante 1-2 minutos, dependiendo de la facilidad con clones quitan las placas, en una incubadora a 37 °. </li><li> Recoge discos clonación utilizando pinzas estériles y transferir en placas de 48 pocillos con medio de 200 l frescas y media concentración del compuesto. </li><li> Pipeta arriba y hacia abajo suavemente para desalojar las células a partir de discos de clonación e incubar O / N a 37 ° C (dejar la clonación de discos en los pozos). </li><li> A la mañana siguiente, retire los discos de clonación de placas de 48 pocillos y reponer pozos con 200 l fresca media / compuesto (concentración de compuesto medio ideal). </li><li> Tres días más tarde, reponer los medios de comunicación con la concentración ideal de compuesto. </li><li> Continuar para cambiar los medios de comunicación / compuesto cada 3-4 días y seguir ampliando clones. </li></ol></li></ol> 4. Evaluación de Grado de Resistencia de clones aislados <ol><li> Una vez 10-20 colonias se expanden, generar GI 50 curvas como se describe en el paso 1 para evaluar el grado de resistencia. </li><li> Siempre incluya poblaciones de control tratados con DMSO durante el proceso de selección. Es muy probable que el espectro de la resistencia va a ser grande (algunos mostrando parcial mientras que otros muestran resistencia completa). Recoger unos pocos clones de cada una de estas clases como el mecanismo de resistencia puede variar entre los dos grupos. </li></ol> Secuenciación 5. La próxima generación <ol><li> Centrifugar 2 millones de células (control y clones resistentes) (500 xg durante 5 min) en viales de 15 ml cónicos, tanto para gDNA y la recogida de ARN (por lo tanto 2 x 2 millones). </li><li> Lavar dos veces con PBS 1x y congelar pellets en -80 ° C hasta que esté listo para el aislamiento. </li><li> Utilice un kit de extracción comercial para aislar ARN o ADNg de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Presentar muestras para la secuenciación de próxima generaciónutilizando el protocolo del proveedor 10. </li></ol> 6. Bioinformática análisis de muestras (secuenciación del exoma) <ol><li> Preproceso secuencia de datos de acuerdo con un ADN-ss tubería mejores prácticas 16. <ol><li> Mostrar en el mapa todas las lecturas para hacer referencia GRCh37 genoma humano utilizando BWA 17. Convertir sin comprimir alineaciones formato SAM a formato BAM comprimido con Samtools 18. Ordenar alineaciones por coordinan con Samtools. Añadir grupos de lectura utilizando Picard. (Para específica BWA, Samtools y Picard comandos, consulte Texto suplementario 1, líneas 1-4) </li><li> Marcar todos los duplicados lee usando el comando MarkDuplicates de la herramienta Picard establecido 19. Índice de este archivo con Samtools. (Texto suplementario 1, líneas 5-6) </li><li> Para minimizar bases coincidentes través de todas las lecturas, realinear lee en destino, en las regiones que albergan pequeñas inserciones o deleciones utilizando un realigner indel 20. (Texto suplementario 1, líneas 7-8) </li><li> Para mejorar aún más la Accuracy de la variante de llamadas, puntajes empíricamente Recalibrar calidad de base utilizando una herramienta recalibración puntuación de calidad de base. La herramienta de calibración de la calidad de base debe no sólo la puntuación correcta calidad inicial, sino también tener en cuenta la covariación de varias características, incluyendo grupo leer, ciclo de la máquina, la posición de base, y el contexto dinucleótido (bases actuales anteriores +). Generar BAM recalibrado con PrintReads Picard. (Para los comandos específicos para este paso, consulte Texto suplementario 1, líneas 9-10) </li><li> Repita los pasos 6.1.1 a través de 6.1.4 (Texto suplementario 1, líneas 1-10) para cada muestra secuenciado. </li></ol></li><li> Identificar la variación de un solo nucleótido (SNV) en cada clon usando una variante emparejado llamando tool19 21-23. Para cada clon secuenciado, variante emparejado ejecutar llamar usando el clon parental como el emparejado &quot;normal&quot;. (Texto suplementario 1, línea 11) </li><li> Filtra recurrentes, variantes de alta calidad y prepararse para la anotación con una herramienta de anotación variante 24. Suprimir las prioridades variants no es común a todos los clones resistentes. (Ver secuencia de comandos R en texto complementario 2) </li><li> Anotar variantes con una herramienta de anotación 25, 26. Muchas herramientas variante de anotación tienen una aplicación web que acompaña permitiendo que los datos que se cargan y procesados ​​por un servidor remoto. </li><li> Use una herramienta de predicción de impacto funcional 27-29 de priorizar aquellas variantes predichas de tener alto impacto funcional. Como variante de anotación, hay varias herramientas disponibles para la predicción del impacto funcional a través de una interfaz web. </li></ol>

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B., Los, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DNA+mismatch+repair:+effects+on+the+rate+of+mutation+to+drug+resistance.">Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance.</a> J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).</li><li>Kotani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+miR-128b+gene+reduces+miRNA+processing+and+leads+to+glucocorticoid+resistance+of+MLL-AF4+acute+lymphocytic+leukemia+cells.">A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).</li><li>Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stroma-mediated+resistance+to+FLT3+inhibitors+in+FLT3-ITD+AML+is+mediated+by+persistent+activation+of+extracellular+regulated+kinase.">Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase.</a> Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).</li><li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade.">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li><li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li></ol>

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Selección de la línea (s) celular: Caracterización del estado genético y la inestabilidad genómica Sin lugar a dudas, el factor más importante en el descubrimiento de los mecanismos de resistencia con éxito clínicamente relevantes es la selección inicial de la línea celular. Se deben considerar dos factores. En primer lugar, el objetivo de seleccionar la línea de células (s) del mismo linaje / subtipo albergar los rasgos genéticos que definen la enfermedad (por ejemplo., BRAF V600E en el melanoma). Interrogación de los datos transcriptómica y mutación públicamente disponibles para ambas líneas celulares y tumores primarios 30-32 / metástasis para una variedad de indicaciones 33,34 facilitará el proceso de selección. Aunque la identificación de líneas celulares con alteraciones genéticas clínicamente relevantes es ideal, en algunos casos esto puede no ser posible debido a la falta de líneas celulares disponibles o viable debido a factores tales como la dificultad y la longitud del proceso de selección. <p class="jove_content"&gt; Con respecto al punto anterior, un segundo factor a considerar a continuación, durante la selección de la línea celular es la facilidad o la viabilidad de la resistencia de detección utilizando la línea deseada. Por ejemplo, factores tales como la proliferación y las tasas de mutación intrínsecas pueden afectar en gran medida de la velocidad de descubrimiento. Con este fin, las líneas celulares pueden ser utilizados con una cinética de crecimiento más rápidas y deficiente en mecanismos de ADN MMR en la esperanza de que la aparición de resistencia espontánea puede acelerarse 35. Sobre la base de la base de datos COSMIC, existen varias líneas de células candidato con deficiencia en uno de los dos genes MMR mutados con frecuencia, MSH2 o MLH1 (Cuadros 2 y 3). Alternativamente, si las líneas celulares de interés no existen defectos en el rodamiento en MMR, tratamiento agudo con mutágenos químicos o físicos ADN reactivos tales como el agente alquilante N-etil-N -nitrosourea (ENU) se puede utilizar para mejorar la inestabilidad genómica. Aunque ambos enfoques May S significativamenteHorten el tiempo para alcanzar los clones resistentes y el seguimiento de la secuenciación, las pruebas funcionales estrictas se debe realizar en genes candidatos como un mayor número de no funcional, las mutaciones de pasajeros es probable que surjan. SNVS puede ser ordenaron para maximizar las posibilidades para la identificación de mutaciones funcionalmente relevantes. En primer lugar, la elección de esas mutaciones que son recurrentes en los clones independientes aumentará la probabilidad de estas mutaciones son conductores de resistencia. En el caso de mutaciones recurrentes no se identifican, centrándose en SNVS que se ajustan al mecanismo de acción del fármaco (por ejemplo, la diana de fármaco o un efector aguas abajo conocida de la diana de fármaco) pueden ser significativa. En última instancia, el patrón oro es siempre evaluación experimental de la actividad que confiere resistencia de los SNVS candidatos de expresión de ADNc ectópica en células parentales sensibles a fármacos. ADN vs secuenciación del ARN Una vez clones resistentes se han generado, el ADN y / o ARNpueden ser secuenciados en función de la necesidad. La secuenciación del ADN, ya sea exoma o secuenciación de todo el genoma, permitirá la identificación de las variantes de la línea germinal y somática, como SNP, indeles y número de copia variantes. Mientras que el más económico de usar la secuenciación del exoma se centra en la generación lee de codificación de las regiones conocidas, la secuenciación del genoma completo generará datos de secuenciación de todo el genoma que puede facilitar la identificación de mutaciones en los elementos no codificantes tales como potenciadores o miRNAs 36. Sin embargo, ya que los datos de expresión génica no se mide durante la secuenciación de ADN, es difícil predecir qué mutación (s) es probable que sea un conductor funcional. En este sentido, la secuenciación de ARN, aunque más costoso, ofrece esta ventaja. El hecho de que la mutación de llamada sólo se realiza en especies de ARN expresadas aumenta la probabilidad de que la mutación de interés puede ser un conductor funcional. Además de permitir un estudio más centrado de mutaciones para la prueba funcional de seguimiento, la secuenciación de ARN tambiénofrece la ventaja añadida de ser capaz de identificar alteraciones genéticas de expresión, corte y empalme alternativo y nuevas especies de ARN quiméricos, incluyendo fusiones de genes que también pueden servir como potentes drivers de resistencia. Tubería de Bioinformática Comandos de ejemplo se proporcionan para fines de ilustración, pero la documentación más detallada y tutoriales están disponibles en el Instituto Broad 16 y deben leerse detenidamente antes de comenzar el análisis de NGS. Los siguientes comandos están diseñados para un entorno de shell de UNIX en un sistema en el que han sido pre-instalado todas las herramientas y los datos de referencia. Estos comandos también asumen archivos FASTQ que contiene la secuencia de extremo emparejado lee de dos muestras, llamado &quot;padres&quot; y &quot;resistente&quot;, se han recibido del proveedor y se coloca en el directorio &quot;data&quot;. En la mayoría de los casos, estos comandos deben adaptarse o optimizados para una aplicación específica utilizando arg de línea de comandos adicionalesdocu- (por ejemplo, añadiendo &quot;-t 8&quot; al comando bwa permite la operación multiproceso en 8 núcleos de CPU). Grupos de lectura (que asignan alineaciones de muestras biológicas), a menudo hay que añadir a los archivos BAM incluso si sólo hay una muestra por cada archivo bam, con el fin de cumplir con los requisitos de formato de archivo para ciertas herramientas. Leer parámetros del grupo RGID, RGSM, RGPL, RGPU y RGLB puede ser cadenas arbitrarias que describen el nombre de la muestra, la plataforma de secuenciación, y la estrategia de la biblioteca. In vitro vs ensayos in vivo Aunque varios mecanismos de resistencia identificados por selección in vitro se han verificado para ser clínicamente relevante, existe una posibilidad de que los mecanismos no pueden servir como mecanismos pertinentes o predominantes de resistencia clínica. Una razón para esto puede incluir un papel esencial para el micro-entorno en la conducción de resistencia a la terapia, un componente que está desprovisto en el protocolo experimental / d de configuracióniscussed hasta el momento. De hecho, varios estudios han demostrado que los agentes anti-cáncer que son capaces de matar las células tumorales se vuelven ineficaces cuando las células tumorales se cultivan en presencia de células del estroma que implican mecanismos innatos de resistencia conferida por el estroma 37,38. Para identificar tales mecanismos de resistencia adquiridos inducida estroma, se puede considerar llevar a cabo in vitro co-cultivo o en ensayos de resistencia tumor in vivo. Desde el anterior ensayo es bastante complejo, muchos han recurrido a la generación de xenoinjertos de tumores resistentes a los fármacos para tratar el posible papel del estroma en la resistencia a la conducción. Tales estudios han descubierto ambos idénticos 5 y 39 únicos mecanismos de resistencia relativa a la selección in vitro, lo que implica que el estroma puede de hecho jugar un papel en este último. Sin embargo, hay que ser consciente de la cantidad de tiempo que puede tomar para generar tumores resistentes tales como la complejidad del seguimiento genómica análisis complexities debido a la heterogeneidad molecular y celular intra-tumoral. Identificación de objetivos Además de descubrir mecanismos de resistencia a fármacos, este enfoque perfil genómico a base de NGS también se puede aplicar para identificar dianas celulares de sondas químicas. Históricamente, múltiples métodos imparciales han sido utilizados para identificar los mecanismos celulares de la acción y las metas de los productos químicos de bajo peso molecular con actividades biológicas, incluyendo la purificación por afinidad junto con la proteómica cuantitativa, métodos genómicos levadura, el cribado RNAi, y la inferencia computacional enfoques 40. Como una extensión a la elucidación de los mecanismos de resistencia a fármacos utilizando el perfil genómico o transcriptómica basada en NGS de las poblaciones de células fenotípicamente resistentes, la identificación de variaciones únicas recurrentes de nucleótido único (SNVS) o alteraciones de expresión que permiten la resistencia puede ofrecer una visión de dianas celulares funcionales de compuestos. Tsu se basa en la idea de que un subconjunto de mecanismos de resistencia observados puede implicar mutaciones recurrentes en los genes que codifican los objetivos directos de proteínas de la molécula pequeña. Recientemente, varios informes validan la utilidad del enfoque, en particular mediante la combinación con otros enfoques, incluyendo a gran escala de sensibilidad línea celular de cáncer de perfiles, para revelar las dianas celulares de molécula pequeña sondas 9,10.

Caracterización molecular detallada de los genomas tumorales de tecnologías de secuenciación robustas y herramientas de análisis de datos mejorada ha llevado al descubrimiento de alteraciones genéticas clave en tipos específicos de cáncer 1,2. El desarrollo de terapias específicas dirigidas a estas lesiones genéticas, como HER2, BCR-ABL, EGFR y ALK, han mejorado significativamente la calidad de vida de los pacientes 1,2. Sin embargo, a pesar de la especificidad de este enfoque, la respuesta clínica a la mayoría de las terapias individuales ha sido subóptima como resistencia emerge en última instancia. Recientemente, se ha hecho un progreso significativo en la comprensión de las bases moleculares de la resistencia a terapias dirigidas. Curiosamente, se está haciendo evidente que un mecanismo prominente de la resistencia implica actividad de destino / vía persistente. Como ejemplo de ello, receptor de andrógenos (AR) -dirigida tratamiento Enzalutamida de cáncer de próstata conduce a un enriquecimiento de la activación de mutaciones en AR sí, manteniendo AR señalización output en presencia del inhibidor de 3-5. Este conocimiento ha conducido a una agresiva campaña para 1) el desarrollo de antagonistas de tercera generación que pueden seguir para suprimir ambos WT y la función mutante-AR en Enzalutamida resistente CP 3 y 2) identificar posibles nodos intermedios de la señalización AR que pueden ser objeto de intervención terapéutica . Del mismo modo, la resistencia a otras clases de inhibidores como los dirigidos EGFR, BRAF y ABL a menudo conducen a mutaciones que reactivan el adictivo quinasa 1 original. Con el conocimiento de que la resistencia surge, inevitablemente, en la mayoría de los pacientes, el desarrollo de enfoques para llevar con prontitud estos mecanismos a la luz que permitirá el desarrollo de terapias eficaces de seguimiento. Un enfoque que está siendo ampliamente utilizado es el de analizar la genómica de los tumores refractarios clínicos en relación a los tumores no tratados previamente o -sensibles para identificar enriquecimientos / agotamientos en lesiones genéticas que pueden ser susceptibles de ddescubrimiento alfombra. A pesar de su promesa, hay dos principales inconvenientes de este planteamiento que dificultan el descubrimiento rápido. En primer lugar, el acceso oportuno a material tumoral para la interrogación genómico puede servir como un obstáculo significativo en el movimiento de la terapia para curar. En segundo lugar, la deconvolución de la gran cantidad de lesiones genéticas en el entorno resistente puede ser un reto ya que los tumores pueden presentar significativa intratumoral heterogeneidad 6,7. A la luz de estos desafíos, se ha incrementado la dependencia de descubrimiento preclínico de los mecanismos de resistencia. Este enfoque puede permitir la identificación de los mecanismos de resistencia importantes antes de los ensayos clínicos 1 que pueden orientar las estrategias alternativas de gestión clínica en los pacientes que llevan estos mecanismos, ya sea antes de la terapia o después de la aparición de resistencias. Una de estas herramientas de descubrimiento preclínico que está siendo ampliamente utilizada es aplicar RNAi pantallas funcionales imparciales. Para examenplo, Whittaker y sus colegas aplicaron una pantalla de RNAi escala del genoma para identificar que la pérdida de la NF1 media la resistencia a los inhibidores de la RAF y MEK través de la activación vía MAPK sostenida 8. Se encontró que estos hallazgos clínicamente relevante como se observó la pérdida de función de las mutaciones en NF1 en las células tumorales -mutant BRAF que son intrínsecamente resistentes a la inhibición de la RAF y en tumores de melanoma resistentes a vemurafenib activación 8. Sin embargo, a pesar del éxito de este enfoque, muchos objetivos clínicamente relevantes a menudo no están identificados, presumiblemente debido a la tendencia de este enfoque de pérdida de función. En contraste, una herramienta para el descubrimiento de menos sesgada preclínica de los mecanismos de resistencia implica la generación de líneas celulares resistentes a través de la exposición prolongada a compuesto de interés junto con el perfil genómico o transcriptómica basado en NGS. Este enfoque se ha aplicado con éxito por varios grupos para identificar espontánearecurrentes individuales variantes de nucleótidos o expresión alteraciones que permiten la resistencia 5,9,10. Por ejemplo, una mutación F876L recurrente en AR fue descubierto recientemente en clones resistentes in vitro 3-5 y en xenoinjertos de tumores in vivo 5 antes de la identificación de esta mutación en la clínica 4. Muy recientemente, bhang y sus colegas (2015) 11 utilizado ClonTracer en dos modelos clínicamente relevantes para demostrar que la mayoría de los clones resistentes que surgen durante la exposición prolongada de drogas eran parte de una preexistente subpoblación que sugiere que las mutaciones más funcionalmente relevante es probable que ya preexistente que se convierten seleccionados para durante la selección 11. En contraste con el perfil genómico de los tumores tratados anteriormente, este enfoque se beneficia de menos heterogeneidad como clones &#39;&#39; homogéneos resistentes se utilizan para el análisis de facilitar la disección genética más precisa de los conductores potenciales. Ademmineral, emocionante, además de la posibilidad de que el descubrimiento de mecanismos de resistencia, este método también se puede aplicar para identificar los mecanismos celulares de la acción y metas de pequeñas moléculas bioactivas para el que esta información es desconocida 10. Dadas las ventajas claras y los múltiples usos de este enfoque, aquí se presenta un protocolo que detalla la implementación exitosa de una pantalla tan preclínico para maximizar el potencial de descubrimientos clínicamente significativas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Para maximizar el potencial para el descubrimiento de los conductores funcionales clave de resistencia, seleccionar clones de células individuales para la expansión, la prueba fenotípica y secuenciación. Como se ilustra en la Figura 4A, las células HCT116 tratadas durante un periodo prolongado con el compuesto citotóxico # 1 conducido a la aparición espontánea de clones resistentes que continuó creciendo durante el tratamiento (círculos negros de trazos). Estos clones fueron recogidos utilizando el enfoque # 1 de relieve en la Figura 3 y posteriormente se amplió para el análisis fenotípico. Como se muestra en la Figura 4B, clones resistentes 1-3 todos mostraron una resistencia significativa en el compuesto # 1 y su cierre compuesto análogo # 2 (mayor viabilidad / crecimiento), mientras que todos los clones mostraron la sensibilidad a un compuesto citotóxico VELCADE no relacionado. Tras la confirmación de la resistencia fenotípica, gDNA fue aislado y sometido a análisis de secuenciación del exoma. Herramientas bioinformáticas se aplicaron a reducir en en esas variantes estructurales queson 1) recurrente y 2) tienen el potencial de impacto funcional (Figura 5A). Variantes estructurales que cumplen estos dos criterios se confirmaron por secuenciación de una herramienta independiente. Como se ilustra en la Figura 5B, una mutación de sentido erróneo heterocigotos que se identificó utilizando la secuenciación del exoma se confirmó usando el método de secuenciación Sanger (panel superior, la secuencia WT; panel inferior, secuencia mutante). Después de confirmación de la secuencia, la línea celular parental utilizada originalmente para el ensayo de resistencia fue genéticamente diseñado para expresar el ADNc mutante para confirmar funcionalmente el papel de la mutación. Como se ilustra en la Figura 6, mientras que la sobreexpresión del ADNc WT no pudo conferir resistencia, la expresión del ADNc mutante confiere significativamente la resistencia fenotípica obligado a compuesto # 1, lo que confirma el papel funcional de esta variación estructural como conductor de la resistencia. Todos los reactivos utilizados para este experimento se resumen en la Tabla 1 </s<html> trong&gt;. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Figura 1. Disposición de placas de ensayo y de control. Sombra azul, pozos de tratamiento de compuestos. Sombra blanca, único medio. Los compuestos se diluyeron en serie 1: 4 y se administran por triplicado (BD o, por ejemplo). 2 compuestos pueden ser aplicados por placa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> Figura 2. Curvas de viabilidad representativos. Línea de puntos rojo representa el eje x día 0 lectura. Indica dosis crecientes de compuesto a la derecha y el eje y representa la viabilidad respecto a los pocillos control de DMSO. GI = 100 dosis utilizada para alcanzar la inhibición del crecimiento 100%; GI 50 = dosis utilizada para reducir la viabilidad de 50% de control de DMSO. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Dos enfoques para recoger clones resistentes para la expansión. Enfoque 1- uso pipeta para recoger y transferir clones bien definidos para placas de 48 pocillos. Enfoque 2- uso tripsina empapado-discos de clonación para levantar clones y transferir a las placas de 48 pocillos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> Figura 4. Confirmación de la resistencia conseguida para clones HCT116 para el compuesto # 1 in vitro. (A) Compuesto # 1 HCT116 clones resistentes surgió siguiente continua la selección de tres semanas. (B) Viabilidad de control de los clones resistentes y se puso a prueba después de un tratamiento de 72 horas con diversos compuestos. Compuesto # 2 es un primer análogo de compuesto # 1. Velcade fue utilizado como un agente citotóxico control. Los datos se muestran como la media + desviación estándar de tres réplicas biológicas. Figura 5. Identificación de una mutación única, recurrente (variantes de un solo nucleótido, SNVS) en el gen A en el compuesto # clones HCT116 1-resistentes. Flujo (A) Trabajar para identificar SNVS presentes en todos los clones resistentes y predice que tienen un impacto funcional de alta por MutationAssessor. (B) La confirmación de la mutación en el gen A por Sanger de secuenciación. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Figura 6. Re-expresión del gen de resistencia conferida A mutado para el compuesto # 1 in vitro. Viabilidad de las líneas celulares HCT116 ingeniería se ensayó después del tratamiento con el compuesto 72 hr # 1. HCT116-WT o líneas celulares mutantes están expresando de forma estable WT o ADNc mutantes del gen A, respectivamente. Los datos se muestran como media + desviación estándar of tres réplicas biológicas. <table><tbody><tr><td> Nombre de la muestra </td><td> Aminoácidos </td><td colspan="2"> Tejido primario </td><td> Cigosidad </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> cerviz </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> cerviz </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> piel </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> P.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> ovario </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> ovario </td><td> Heterocigota </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> pecho </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> p.? </td><td colspan="2"> próstata </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> p.? </td><td colspan="2"> intestino grueso </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> intestino grueso </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> endometrio </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> endometrio </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Líneas MSH2 -mutated celulares. Línea celular (nombre de la muestra), sustitución de aminoácidos, el linaje de origen y el cigosidad se indican. <table><tbody><tr><td> Nombre de la muestra </td><td> Aminoácidos </td><td colspan="2"> Tejido primario </td><td> Cigosidad </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> intestino grueso </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> p.? </td&gt; <td colspan="2"> próstata </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> intestino grueso </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> ovario </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> estómago </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> p.? </td><td colspan="2"> piel </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> REH </td><td> p.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homocigótica </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> P.0? </td><td colspan="2"> ovario </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> intestino grueso </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> intestino grueso </td><td> Homocigótica </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> páncreas </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> páncreas </td><td> Heterocigota </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> páncreas </td><td> Heterocigota </td></tr></tbody></table> Tabla 2. MLH1 -mutated Líneas celulares. Línea celular (nombre de la muestra), sustitución de aminoácidos, el linaje de origen y el cigosidad se indican.

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Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Resistencia a los medicamentos para terapias dirigidas es generalizada y la necesidad de identificar mecanismos de resistencia - antes o después de la aparición clínica - es fundamental para guiar las estrategias de gestión clínica alternativas. A continuación, presentamos un protocolo para acoplar derivación de líneas resistentes a los fármacos in vitro con la secuenciación para acelerar el descubrimiento de estos mecanismos.

Implementación de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga Resistencia Ensayos: Maximizar el Potencial de Descubrimiento clínicamente relevantes mecanismos de resistencia

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Investigación

Medicina

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Optimización Del Cultivo Celular De Glioma De Alto Grado De Muestras Quirúrgicas Para Su Uso En Modelos Animales Clínicamente Relevantes E Inmunoquímica 3D

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Un método de monitoreo asequible VIH-1 Resistencia a los medicamentos para los entornos con recursos limitados

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de transferencia de genes y<em&gt; In vitro</em&gt; ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Adapted Resistance Training Improves Strength in Eight Weeks in Individuals with Multiple Sclerosis

Entrenamiento de la resistencia Adaptado mejora la fuerza en ocho semanas en personas con esclerosis múltiple

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

Un modelo para simular la hipoxia clínicamente relevantes en seres humanos

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

Un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...