Name: generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids at JoVE.com

The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) wurden aus menschlichen peripheren Blut-Proben nach der unterzeichneten Einverständniserklärung und Zustimmung der Ethikkommission der Provinz Bozen gesunden Spendern isoliert. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den in der Deklaration von Helsinki verankerten Grundsätze durchgeführt. Alle Daten wurden gesammelt und anonym ausgewertet. 1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC) <ol><li> PBMNCs aus Buffy Coats nac...

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells).">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells).</a> Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector.">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li><li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune,+a+non-integrating+Sendai+virus.">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).</li><li>Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA.">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci. Rep. 2, 657 (2012).</li><li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotency:+history,+mechanisms,+and+applications.">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).</li><li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures.">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li><li>Streckfuss-Bomeke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+bone+marrow+cells,+hair+keratinocytes,+and+skin+fibroblasts.">Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts.</a> Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).</li><li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+mouse+and+human+cells+to+pluripotency+using+mature+microRNAs.">Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs.</a> Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+human+hair+follicle+mesenchymal+stem+cells.">Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).</li><li>Beltrao-Braga, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+immature+dental+pulp+stem+cells.">Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells.</a> Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).</li><li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood.">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li><li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li><li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+and+efficient+cellular+substrate+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adults:+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).</li><li>Hasegawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+reprogramming+efficiency+between+transduction+of+reprogramming+factors,+cell-cell+fusion,+and+cytoplast+fusion.">Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion.</a> Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), 2565 (2010).</li><li>Fleige, S., Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+and+the+effect+on+the+real-time+qRT-PCR+performance.">RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).</li><li>Meraviglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chorionic+villus+mesenchymal+stromal+cells+reveal+strong+endothelial+conversion+properties.">Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties.</a> Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).</li><li>Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+metaphase+chromosome+set+by+aid+of+DNA-binding+fluorescent+agents.">Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents.</a> Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).</li><li>Alikani, M., Munne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviable+human+pre-implantation+embryos+as+a+source+of+stem+cells+for+research+and+potential+therapy.">Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy.</a> Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).</li><li>Tropel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+following+pre-implantation+genetic+diagnosis.">High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell+reprogramming+is+a+stochastic+process+amenable+to+acceleration.">Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.</a> Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ink4/Arf+locus+is+a+barrier+for+iPS+cell+reprogramming.">The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming.</a> Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li><li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus:+mechanistic+insights+into+efficient,+licensed,+extrachromosomal+replication+in+human+cells.">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li></ol>

In der Vergangenheit war die einzige Möglichkeit, menschlichen pluripotenten Stammzellen, die einen bestimmten genetischen Mutation zu erhalten war, die Eltern unterziehen vor der Implantation genetische Diagnose zu rekrutieren und zu erzeugen embryonale Stammzellen aus ihrem verworfen Blastozysten 31,32. Unter Verwendung einer Neuprogrammierung Ansatz können die Forscher nun iPS von Patienten trägt nahezu jeder Genotyp zu erzeugen. Die Möglichkeit, von einem patientenspezifischen Zelllinie beginnen und e...

In 2006 hat die Gruppe von Shinya Yamanaka 1 gezeigt, zum ersten Mal, dass Körperzellen aus adulten Mäusen und Menschen können durch ektopische Expression von vier Reprogrammierungsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und in einem pluripotenten Zustand umgewandelt werden c-Myc), die Erzeugung der sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) 2. Patientenspezifische iPSCs ähneln menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) in Bezug auf die Morphologie, Proliferation und die Fähigkeit, in die drei Keimzelltypen (Mesoderm, Endoderm und Ektoderm) differenzieren, während ohne die ethische Bedenken auf die Verwendung von HES-Zellen und Bypass zugeordnet mögliche Immunabstoßung 3. Somit iPSCs erscheinen als eine der wichtigsten Quellen von patientenspezifischen Zellen für die Grundlagenforschung, Drug Screening, Krankheitsmodelle, Bewertung der Toxizität und der regenerativen Medizin Qualität 4. Es wurden mehrere Ansätze für iPSC Generation verwendet: viralen Integrationsvektoren(Retrovirus 5, Lentivirus 6), virale nicht-Integrationsvektoren (Adenovirus 7), Sendai-Virus-8, BAC Transposons 9, episomale Vektoren 10, 11 Proteine ​​oder RNA-Lieferung 12. Obwohl die Verwendung von Virus-vermittelte Methoden können eine hohe Effizienz Neuprogrammierung führen, in das Genom der Wirtszellen und daher potentielle Zufalls Insertionsmutagenese integrieren virale Vektoren können permanente Veränderung der Genexpression und Reaktivierung von Schweigen Transgenen während der Differenzierung nicht ausgeschlossen werden 13. Um iPSCs sicherer für die regenerative Medizin zu machen, wurden Anstrengungen unternommen, um iPSCs ohne die Integration von exogener DNA in zelluläre Genome abzuleiten. Obwohl verbrauch viralen Vektoren und Transposons entwickelt wurden, ist es noch unklar, ob die kurze Vektorsequenzen, die zwangsläufig verbleiben in den transduzierten Zellen nach der Exzision und Transposaseexpression könnte Veränderung Zelle induzierendere funktionieren 13. Trotz seiner hohen Effizienz Neuprogrammierung, Sendai-Virus stellt eine teure Vorgehensweise und zu erreichen, durch Lizenz Anliegen mit dem Unternehmen, die dieses System entwickelt, haben das Potenzial, ihre Anwendung in der translationalen Studien zu begrenzen. Darüber hinaus die Notwendigkeit für eine direkte Einführung von Proteinen und RNA erfordert mehrere Lieferung der Neuprogrammierung Moleküle mit den innewohnenden technischen Beschränkungen dieser führt, und die allgemeine Anpassung Effizienz ist sehr gering 14. Zu beachten ist, kosteneffektiv virale frei und nicht-integrierenden Methoden basierend auf der Verwendung von episomalen Plasmiden wurden erfolgreich für die Umprogrammierung der Hautfibroblasten 15 gemeldet. Insbesondere wird in der vorliegenden Arbeit haben wir beschlossen, im Handel erhältlichen Integration freien episomalen Plasmiden verwenden, wie bereits berichtet 10,15. Bisher Haut-Fibroblasten stellen die beliebtesten Spenderzelle Typ 5. Aber auch andere Zellquellen wurden successfully in iPSCs einschließlich Keratinozyten 16, Knochenmark mesenchymale Stammzellen 17. Fettgewebe Stromazellen 18 umprogrammiert, Haarfollikel 19 und Zahnmark-Zellen 20. Die Isolierung dieser Zellen erfordert chirurgischen Verfahren und mehreren Wochen werden für in vitro-Zellexpansion, um eine primäre Zellkultur zu etablieren benötigt. In diesem Licht ist die Auswahl der Ausgangszelltyp kritisch und es ist ebenso wichtig, iPSCs von leicht zugänglichen und weniger invasiv Geweben wie Blut erzeugen. Beide Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMNCs) 21,22 und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) 14,22-24 repräsentieren geeignete Quellen von Zellen für die Ableitung iPSCs. Obwohl die Effizienz der erwachsenen PBMNC Umprogrammieren 20-50 mal niedriger als die von CBMNCs 22, bleiben sie die bequemste Zelltyp für die Beprobung. InTatsächlich hat PBMNC Probenahme den Vorteil, dass minimal-invasive, und außerdem sind diese Zellen nicht umfangreiche Expansion in vitro vor der Reprogrammierung Experimente erfordern. Bislang wurden unterschiedliche Protokolle berichtet, dass PBMNCs nach Dichtegradienten-Trennung nach dem Gefrieren eingefroren und aufgetaut Tage bis mehrere Monate und für einige Tage expandiert, bevor für die Umprogrammierung in iPSCs 22,23. Dennoch, soweit wir wissen, keine Berichte Umprogrammierung PBMNCs aus gefrorenen Buffy Coats beschrieben. Wichtig ist, dass gefrorene Buffy Coats ohne Dichtegradiententrennung gesammelt stellen die in großem Umfang von Biobanken Bevölkerungsstudien gespeichert und stellt somit eine leicht zugängliche Pool von Material für iPSC Produktion, die weitere Probennahme vermeidet häufigsten Blutproben. Berichten wir hier zum ersten Mal die Erzeugung von Virusfrei iPSCs aus menschlichen gefrorenen buffy coats, basierend auf einem zuvor beschriebenen Protokoll 22. InAußerdem wurden aus gefrorenen iPSCs PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten erzeugt als Steuerprotokoll für die nicht-Dichtegradienten gereinigt PBMNC Ergebnisse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>VF-054SBCS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>0.5 M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Premium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Polysucrose solution for density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium (IMDM)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21056-023</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056&#160;</td>
			<td>1X (Stock: 100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td>1X (Stock: 100X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td>Final Concentration at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>100 ng/ml (Stock:100 &#181;g/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>10 ng/ml (Stock: 10 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-11</td>
			<td>40 ng/ml (Stock: 40 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Erythropoietin (EPO)</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td>2 U/ml (Stock: 50 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td>1 &#956;M (Stock: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Holo-Transferrin</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>2914-HT</td>
			<td>100 &#956;g/ml (Stock: 20 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amniomax II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11269016</td>
			<td>Medium for cytogenetic analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Medium for iPSC feeder-free culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>0.1 mM (Stock: 50 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>0.25 mM (Stock: 0.5 M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic, 145 aa&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>4114-TC</td>
			<td>10 ng/ml (Stock: 10 &#181;g/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503&#160;</td>
			<td>10 &#181;M (Stock: 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Defined Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH 30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104-019</td>
			<td>1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA Laboratories GmbH</td>
			<td>L11-007</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)</td>
			<td>Global Stem</td>
			<td>GSC-6201G</td>
			<td>1*106 cells/6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27077</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27078</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27080</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCXLE-EGFP</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>27082</td>
			<td>1 &#181;g (Stock: 1 &#181;g/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Staining Kit</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4304</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>MAB4381</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Oct-3/4 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9081</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nanog Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-33759</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Troponin I Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-15368</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin (Sarcomeric) Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7732</td>
			<td>1/250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuronal Class III &#223;-Tubulin (TUJ1) Antibody</td>
			<td>Covance Research Products Inc&#160;</td>
			<td>MMS-435P-100</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>657012</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21429</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596-018&#160;</td>
			<td>reagent for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11754050</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>185-5195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion Automated Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>700-7000</td>
			<td>Instrument to check RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experion RNA Highsense Analysis kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7007105</td>
			<td>Reagent kit to check RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeonTransfection System 100 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK10025</td>
			<td>Reagent kit for electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Instrument used for electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Instrument for DNA/RNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid purification kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids

Somatischen Zellen kann durch die Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und c-Myc) zwingt in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) umprogrammiert werden, typischerweise durch menschliche embryonale Stammzellen exprimiert (hES) . Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit HES-Zellen, haben iPSCs ein wichtiges Instrument für potenzielle Patienten-spezifischen regenerativen Medizin zu werden, die Vermeidung ethischer Fragen mit HES-Zellen verbunden. Um geeignete Zellen für die klinische Anwendung zu erhalten, müssen Transgen freien iPSCs erzeugt werden, um transgene Reaktivierung veränderte Genexpression und fehlgeleiteten Differenzierung zu vermeiden. Außerdem ist eine hocheffiziente und kostengünstige Anpassung Verfahren notwendig, eine ausreichende iPSCs für therapeutische Zwecke abzuleiten. Angesichts dieser Notwendigkeit, ist eine effiziente Integration von nicht-episomale Plasmid-Ansatz die bevorzugte Wahl für iPSC Ableitung. Derzeit die häufigste Zelltyp für eine Neuprogrammierung Zwecke sind Fibroblasten, die Isolierung von denen erfordert Gewebebiopsie, eine invasive chirurgischen Prozedur für den Patienten. Daher menschlichem peripheren Blut stellt den am besten zugänglichen und am wenigsten invasive Gewebe für iPSC Generation. In dieser Studie wird ein kostengünstiges und virale freies Protokoll unter Verwendung nicht-integrierenden episomalen Plasmiden zur Erzeugung iPSCs aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC), nachdem Gesamtblut zentrifugiert und ohne Dichtegradiententrennung aus gefrorenen Leukozytenfilmen berichtet wird.

In dieser Studie wurde ein einfaches und wirksames Protokoll für die Erzeugung von Virusfrei iPSCs durch Umprogrammierung PBMNC aus gefrorenen buffy coats, nachdem Gesamtblut zentrifugiert und Vergleich mit Umprogrammierung PBMNCs nach Dichtegradiententrennung wird berichtet, erhalten wurde, isoliert. 1A zeigt eine schematische Darstellung das detaillierte Protokoll. Nach dem Auftauen werden die isolierten PBMNC, welches einen typischen abgerundete Form werden in spezifischen Blutkulturmedium für 14 T...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids at JoVE.com

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...