Name: applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling at JoVE.com

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

Ilgi konusu proteini eksprese eden kararlı hücre soyları 1. Üretim <ol><li> Isı ile inaktive edilmiş FCS ve% 1 penisilin / streptomisin eklenmesi ile ortamı hazırlamak ticari olarak temin edilebilen Dulbecco&#39;s GlutaMAX-I, piruvat, ve 4.5 g / L D-glükoz ile takviye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) Modifiye etmek. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de ortam içinde HEK293 hücrelerinin geliştirin. Her üç günde bir hücrelerini Alt yetiştirmek. Ortamı çıkarın ve 15 ml taze medya hücr...

Birçok patojen bakteri salgılar veya konakçı hücreye bakteri efektör proteinleri yerini değiştirmek için salgılama sistemleri liman. Bu efektör proteinler bakteriler hayatta ve ilgili hücre içi niş içinde kopyalanmasına olanak tanıyan, konakçı hücre süreçleri ve yolların modüle kapasitesine sahiptir. Biyokimyasal faaliyetler ve efektör proteinlerin moleküler mekanizmaların anlaşılması patojenite daha iyi anlaşılmasına yönelik yardımcı olacak ve bu hastalıkla mücadele için yeni teda...

birçok Gram-negatif bakteriyel patojenlerin hastalık oluşturma ökaryotik konakçı hücreleri kaçırmak için özel bir salgı sistemleri bağlıdır. Bakteriler hücresel ve biyokimyasal çeşitli aktiviteler modüle edilmesi için bir ev sahibi hücre içerisine bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri (efektörler) enjekte etmek için, bu salgılama sistemleri kullanırlar. efektör proteinlerin çalışma konak / patojen etkileşimleri temel yönlerini içine değil, aynı zamanda ökaryotik hücreler 1 temel biyoloji içine olağanüstü bir fikir vermiştir sadece. Konakçı hücre, apoptoz modülasyonu birçok hücre içi patojenler için önemli bir virülans mekanizma olduğu gösterilmiştir, ve apoptoz modüle efektör protein bir dizi 2-9 tespit edilmiştir. Bununla birlikte bir aktivite bunların kesin moleküler mekanizmalar birçok durumda halen mevcuttur. Apoptoz, programlanmış hücre ölümü olup, enfeksiyon 10 immün yanıtlarda önemli bir rol oynamaktadır. Apoptoz giden iki ana yollar vartespit edilmiştir: plazma zarı (dışsal apoptosis) hücre ölümü reseptörleri aracılığıyla mitokondri (içsel apoptosis) ya da sinyal iletimini doğrudan hedef. intrinsik veya mitokondri aracılı hücre ölüm yolunu hücre içi sinyaller ile tetiklenir ve Bax ve Bak, Bcl-2 ailesine ait iki pro-apoptotik üye aktivasyonunu içerir edilir. Bu aile hücre ölümü 11-14 kontrol pro- ve anti-apoptotik düzenleyici protein oluşmaktadır. Bax ve Bak sitoplazmaya sitokrom C salınımı ile sonuçlanan, mitokondriyal dış membran daha sonra permeabilization ardından apoptoz aktivasyonu oligomerizasyonu yol açar. Sitokrom C salma apopitozom 15 kaspaz 9 aktivasyonu yoluyla efektör kaspaz 3 ve 7 aktivasyonunu başlatır. Bu diğerlerinin yanı sıra, hücre yüzeyi 16 fosfatidilserin maruz sonuçlanır, seçilen alt-tabakaların proteoliz yol açar ve CH fragmanları özel bir DNaz boşaltırromatin 17,18. Bağımsız bir efektör protein, müdahale eden apoptotik kaskad içinde indüklenebilir bir ekspresyon sistemi 19 kullanılmıştır belirlemek amacıyla. Transgenlerin koşullu ifadesi için düzenleyici sistemler hücre içinde bir proteinin fonksiyonunu veya doku, organ ve organizma gelişimi için önemini, hem de inisiyasyon, ilerlemesi ve hastalık 20-23 bakımı sırasında analiz değerli bir araç olmuştur. Tipik haliyle, örneğin Tet sistemi Burada kullanılan 24 indüklenebilir kontrol sistemleri, yapay bir transkripsiyon birimi (Şekil 1 e bakınız) oluşturur. Bir bileşen, transkripsiyonel aktivasyonu veya 24,26 susturulması aracılık eden bir memeli protein etki bakteriyel transkripsiyon bastırıcı TetR 25 füzyonu ile oluşturulan tTA (tetrasilin bağımlı transkripsiyon aktivatörü) olarak adlandırılan bir yapay tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüdür. İkinci bileşen, bir melezpromoteri, en az bir TATA-kutu ve bir transkripsiyon başlatma bölgesi içeren, bir ökaryotik minimal promotör aşağıdakilerden oluşan, TRE (tetrasiklin-duyarlı öğesi) olarak adlandırılan TetR, teto 24,25 için aynı kökenli DNA bağlanma sitesi birden fazla kopyası katıldı. Üçüncü bileşen TetR, tetrasiklin ya da anhydrotetracycline veya doksisiklin 25 bunun türevleri, biri doğal bir liganddır. Kültür ortamına ligand ilave edilmesinden sonra, TetR teto için afiniteye kaybeder ve TRE ayrışmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, hedef genin transkripsiyonu kaldırılmıştır. Transgen ekspresyonu, bu nedenle sıkı bir şekilde her iki hücre kültüründe, bir zaman ve doza bağlı bir şekilde ve hayvanların 20,23,24 kontrol edilebilir. TTA&#39;nın ile, transgen ekspresyonu, tetrasiklin varlığında dışında, yapısal olarak ortaya çıkar. Tetrasiklin transgen expressio önce sistemden çıkarılması gerekir, bu sitotoksik veya onkojen protein çalışmada bir dezavantaj olabilirN oluşur ve hücre hedef proteinin etkisi izlenebilir. Bu zaman alıcı olabilir ve özellikle transgenik hayvanlarda 27, her zaman tam değil olabilir. Bu sınırlama çözmek için, doksisiklin varlığına ters yanıt veren bir TetR mutant yeni bir transkripsiyon faktörü üretmek için kullanıldı, rtTA 28 (tTA ters). Sadece TRE bağlanan ve eş zamanlı olarak, doksisiklin varlığında transkripsiyonu aktive eder. Sistem, örneğin, kalıntı leakiness. TRE-bağlanmış transkripsiyon faktörünün yokluğunda transgen ekspresyonu, bir genomik entegrasyon sahasında pozisyon etkilerinden ya (i) menşeli, (ii) TRE kendisinin 29, ya da (iii) dan -spesifik tTA / rtTA 28 bağlanmasını, ek bir transkripsiyonel susturucu getirerek hitap etti, sisteme (tetrasiklin bağımlı transkripsiyon susturucu) 30 TTS adlandırılan. Bu rtTA (Şekil 1 e bakınız) ile birlikte bir ikili regülatörü ağı oluşturur.Doksisiklin yokluğunda TTS TRE bağlanan ve aktif bir diğer transkripsiyon kapanır. Doksisiklin varlığında TTS TRE ayrışmaktadır ve rtTA aynı zamanda, hedef genin ekspresyonunu indükleyen bağlar. Sıkılık Bu ek tabaka, yüksek ölçüde aktif, sitotoksik proteinleri 31-34 ifade etmek çoğu zaman gereklidir. Bu sıkı bir şekilde kontrol çift regülatör sistemi kullanarak, apoptotik kaskad verilen efektör protein, apoptosisin engelleyebilir olmadığı analize izin tanımlanmış bir adımda başlatılabilir. Bu yöntem, yalnızca bakteriyel efektör protein, anti-apoptotik aktivitesi çalışma için kullanılan hem de pro-apoptotik ya da toksik proteinlerin uyanlabilir ifadesi için ya da diğer sinyal yollarının parazit kesme için mümkün değildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

Burada sunulan teknik, bir sinyal yolunun bileşenleri ile etkileşime girer, biri bir hedef proteini ya da alternatif olarak, küçük bir molekül adım analiz etmeyi sağlar. yöntem dayanır, bir yandan, belirli bir proteinin endüklenebilir ifadesi üzerindeki seçilen sinyalleşme kademeli olarak tanımlanmış ve önceden tespit edilmiş bir aşamada bir sinyal olayını gerçekleştirmek için kullanılır. Ifade edilen hedef proteinin aktivitesi elde edilen sinyal yolunun okumaya bağlı olarak, yukanya doğru yer alan veya başlatılan sinyal olayının alt baş halinde birlikte ifadesi, diğer yandan, söz konusu genin, sonra araştırmacı değerlendirmelerini sağlar. Burada, apoptotik kaskad protokolü özelliğe göstermek için belirli bir sinyal yolu olarak seçilmiştir. Böyle Coxiella burnetii gibi patojenik bakteriler, hücre içinde bakteri hayatta kalmasını sağlamak için konak hücreye konak hücre ölümü indüksiyon müdahale efektör proteinleri yerini değiştirmek ve geliştirmek için onlarınOrganizmada yaygınlaştırılması. C. burnetii&#39;nin efektör protein, CaeB etkili bir UV ışığı veya staurosporin ile apoptoz indüksiyonu sonrasında konakçı hücre ölümünü engeller. Adım CaeB apoptotik sinyalin yayılma müdahale ettiği daraltmak için, iyi karakterize edilmiş, pro-apoptotik etkinliğe sahip seçilen proteinler doksisiklin indüklenebilir bir şekilde geçici olarak ifade edilmiştir. CaeB Bu proteinlerin yukarı hareket ederse, apoptoz engelsiz devam edecektir. CaeB aşağı hareket ederse, hücre ölümü önlenir. seçilen test proteinleri büyük cellat proteazıdır mitokondri düzeyi ve kaspaz 3, en davranır Bax idi. CaeB Bax ifadesi ile indüklenen hücre ölümü engeller, ama kaspaz 3 sentezlenmesiyle. CaeB, bu şekilde, bu iki protein arasında apoptotik kaskad ile etkileşime girer.

İlk olarak, bir GFP füzyon proteini olarak kararlı bir şekilde ilgi (CaeB) proteinini eksprese eden HEK293 hücre soyları kurulmuştur. Bir kontrol olarak, kararlı bir şekilde GFP eksprese eden HEK293 hücre hatları da oluşturulmuştur. GFP ve GFP-CaeB sentezlenmesi bağışıklık beneklenme analizi ile doğrulanmıştır. Örnek immünoblot (Şekil 4A), GFP ve GFP-CaeB istikrarlı ve net bir şekilde tespit edilebilir ifadesi gösterilmiştir. Tüm hücreleri GFP veya GFP-CaeB ifade edip Anca...

Watch this Scientific Journal Video about Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling at JoVE.com

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon<em&gt; Manduca Sexta</emBakteriyel virülans Değerlendirememesi&gt; Larva

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...