Name: implantation of miniosmotic pumps and delivery of tract tracers to study brain reorganization in pathophysiological conditions
Uploaded: 2016-01-18T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions at JoVE.com

This work was supported by the Dr. Werner Jackst&#228;dt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).

Los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del gobierno (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 y G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) basado en directrices de NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Bombas 1. Preparación de miniosmótica <ol><li> En un entorno estéril (es decir., Campana de cultivo de células), obtener la bomba, catéter, moderador, infusión de cerebro cánula y los discos distanciadores para ser utilizado (Figura 1) de flujo. </li><li> Para la entrega de medicamentos directamente en los ventrículos utilizar un disco espaciador de modo que sólo la punta de la cánula de la aguja está en contacto con el ventrículo. Sujete la cánula al revés con un fórceps. Añadir dos gotas de adhesivo de cianoacrilato (CA) e introducir un disco espaciador. </li><li> Deja la cánula sobre una superficie plana orientada hacia arriba de manera que el pegamento entre el disco espaciador y se seca la cánula. </li><li> Cortar el catéter en secciones de aproximadamente 2,5 cm. </li><li> Para eabomba ch, preparar un mínimo de de 300-350 l de la solución de interés, ya que será necesaria para llenar completamente la bomba de extrusión por lo tanto todo el aire dentro de ella para evitar la formación de burbujas dentro del catéter. Bubbles impedirá el flujo de la solución en el cerebro. </li><li> Conectar cuidadosamente el catéter hasta el moderador de flujo. </li><li> Usando una jeringa de 2 ml conectado a la aguja proporcionado por el kit de infusión de cerebro, llenar la bomba hasta que una pequeña cantidad de solución escapa de la bomba, evitando de este modo las burbujas de aire en su interior. </li><li> Llene cuidadosamente el moderador de flujo y el catéter de prestar atención a impedir la realización burbujas restantes en el interior del catéter. </li><li> Introducir el moderador de flujo dentro de la bomba. </li><li> Una vez lleno, conecte cuidadosamente la cánula al extremo del catéter. Si se observa que una burbuja se forma quitar la cánula y cuidadosamente rellenar el catéter con vehículo o solución de fármaco y luego reintroducir la cánula. </li><li> Coloque el pump en un recipiente con solución salina estéril y dejar a 37 ° CO / N. </li><li> Antes de la implantación vuelva a revisar para la formación de burbujas. Si es necesario (es decir., Se observan burbujas) retire la cánula y vuelva a llenar el tubo. Vuelva a conectar la cánula. Esto debería tomar sólo unos pocos microlitros de solución. </li></ol> Bombas 2. Implantación de miniosmótica Nota: Para estos experimentos los animales fueron anestesiados por 1% de isoflurano (30% O 2, el 70% de N 2 O). Sin embargo, si esto no está disponible, el uso de inyecciones intraperitoneales de anestesia También es posible 11. <ol><li> Busque el animal en el dispositivo estereotáctico bajo anestesia y cubrir los ojos con un ungüento de protección para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirmar la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta en la pata trasera cuando se presiona con los dedos o con un fórceps. No continúe hasta que el animal está completamente dormido. </li><li> Cortar la piel sobre la queanuncio, ya sea con unas tijeras o una máquina de afeitar. Cortar tanto como sea posible sin dañar la piel. </li><li> Limpiar la piel con etanol 70% y desinfectante con propiedades antibacterianas y fungicidas. </li><li> Con un escalpelo abrir una incisión de 1 cm ligeramente a la derecha de la línea media y exponer el cráneo. </li><li> Limpie el cráneo con un hisopo de algodón. Remojar con etanol al 70% y pasarlo sobre el cráneo. Esto inducirá el cráneo se seque. </li><li> Si el cráneo tiene sangrado ligero, use un cauterizador para eliminar ningún punto de sangrado. La sangre impide que la CA se seque adecuadamente sobre el hueso una vez se implanta la cánula. </li><li> Utilice el dispositivo estereotáctica para hacer una marca en el punto del cráneo donde se implantará la cánula. Para infusiones ventriculares en las coordenadas hemisferio izquierdo son -0.2 mm caudal, 0,9 mm lateral al bregma (Figura 2). </li><li> Perforar suavemente sobre el cráneo haciendo un ángulo de 45 °; esto evita que el taladro de ir accidentalmente en el Brainorte. Repetidamente perforar durante unos segundos y luego verifique la profundidad del agujero es. Deje de perforar una vez que el cráneo se ha adelgazado, pero aún no está totalmente penetrado. </li><li> Romper las meninges con la punta de una aguja estéril hasta que se logre el pleno acceso al cerebro. Hágalo con cuidado para no dañar el cerebro. </li><li> Limpie el cráneo con etanol al 70% utilizando un hisopo de algodón. </li><li> Introducir un fórceps rectos debajo de la piel del animal en una dirección antero-caudal. Utilice las pinzas para abrir el espacio de debajo de la piel en el lomo del animal en la que se implanta la bomba. Introducir la bomba en la parte posterior del animal dejando el catéter y la cánula exterior (Figura 2B). La bomba se mantendrá en esta posición hasta que se retira y no necesita ningún tipo de fijación. </li><li> Colocar con cuidado cuatro pequeñas gotas de pegamento al lado de la aguja en la cánula. </li><li> Introducir cuidadosamente la aguja a través del cráneo sin moverlo hacia los lados. Manténgalo en posición durante 15 a 30 segundos uasta la cánula está completamente unido (Figura 2C.1). Una vez en su lugar, la cánula llegará a 2,5 mm en la dirección ventral dorso si un disco espaciador se ha utilizado. Si adjunta correctamente, la cánula permanecerá adherida al hueso hasta el final del experimento. </li><li> Coloque un dedo sobre la lengüeta extraíble y luego usar la otra mano para cortarlo por el cuello con un conjunto de tijeras (Figura 2C.2). </li><li> Cierre de la herida en la piel con una sutura de 5-0 y añadir unas gotas de solución de povidona yodada (PVP-I) en la parte superior de la herida para prevenir la infección (Figura 2D). </li><li> Mueva el animal en una nueva jaula. No coloque animales operados con animales que aún no han sido operados. Mantenga a los animales que han sido implantados con bombas solos en sus jaulas durante el momento de la administración del fármaco. </li><li> No deje los ratones sin vigilancia hasta que estén despiertos y han recuperado decúbito esternal. </li></ol> 3. Bomba Removal Nota: Por lo general, el experimento terminará al final del plazo de entrega permitido por la bomba, sin embargo, es posible quitar la bomba con el fin de hacer experimentos secundarios como un seguimiento de la administración de fármacos. Con el fin de hacer inyecciones de trazadores de las vías por lo que es necesario retirar la bomba. <ol><li> Colocar el animal en el dispositivo de seterotactic bajo anestesia y cubrir los ojos con pomada protectora para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirmar la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta en la pata trasera cuando se presiona con los dedos o con un fórceps. No continúe hasta que el animal está completamente dormido. </li><li> Abrir con cuidado la piel cortando a través de la incisión realizada en el día de la implantación de la bomba. </li><li> Con una pinza quirúrgica sostener la cánula y tire de ella. Se debe retirar fácilmente del cráneo. Como se espera sangrado suave, detenerlo mediante la colocación de un hisopo de algodón y esperar 1-2 minutos. </li><li> Tire de la bomba por el catéter. Éllp que os salga empujándola, creando presión sobre la piel. </li><li> Cierre de la herida de nuevo con una sutura de 5-0 y añadir unas gotas de PVP-I. </li><li> Mueva el animal en una nueva jaula. No coloque animales operados con animales que aún no han sido operados. Los animales que han sido sometidos a cirugía se pueden juntar. </li><li> No deje los ratones sin vigilancia hasta que estén despiertos y han recuperado decúbito esternal. </li><li> Deje que el animal se recupere durante 10 días antes de proceder a la inyección de trazador vías. </li></ol> 4. Presión Tracto trazador inyección en ángulos de 45 ° sobre el derecho Corteza Motora <ol><li> Colocar el animal en el dispositivo estereotáctico bajo anestesia y cubrir los ojos con un ungüento de protección para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Confirmar la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta en la pata trasera cuando se presiona con los dedos o con un fórceps. No continúe hasta que el animal está completamente dormido. </li><li> Abra la herida en la cabeza. </li><li> doincline el cráneo con un 70% de etanol utilizando un hisopo de algodón. </li><li> Introducir una jeringa de vidrio de 5 l (26S ga) en el soporte vertical del dispositivo. Asegúrese de que el extremo inferior del soporte de vidrio es, precisamente, en la pieza de sujeción. La jeringa no debe ser demasiado lejos por debajo de ella como entonces será imposible para colocarlo en 45 ° desde la posición vertical y realizar la inyección. </li><li> Oriente la jeringa directamente sobre bregma y busque las coordenadas deseadas. Para una inyección en las coordenadas corteza motora son: Punto # 1: +0,5 mm rostral y 2,5 mm lateral con respecto al bregma. Punto # 2: 1,34 mm rostral, 2,5 mm lateral con respecto al bregma. </li><li> Una vez que las coordenadas se han localizado, indicar su posición sobre el cráneo con un marcador con una punta fina. Hacer sólo un punto en el cráneo como la liberación de tinta excesiva podría ocultar la correcta coordenadas. </li><li> Perforar con cuidado el cráneo que sostiene el taladro a 45 °. Como en el paso 2.8, compruebe el cráneo con frecuencia por lo que no es totalmente perfcorporado con el fin de evitar daños en el cerebro causada por el taladro. Utilice la punta de una jeringa para asegurar que todo el hueso se ha eliminado. </li><li> Carga de 600 nl de dilución del trazador tracto dentro de la jeringa. </li><li> Ajustar la posición vertical a 45 ° hacia el lado derecho del animal. Bajo el microscopio, coloque la punta de la aguja de la jeringa justo en frente del agujero. </li><li> Moverlo en la dirección vertical de 1,5 mm. Deje la aguja constante en esta posición durante 30 segundos a 1 minuto antes de hacer inyecciones de presión. </li><li> Inyectar 300 nl de dilución trazador en tres pasos de 100 nl separadas entre sí por 30 seg. Después de la última inyección, deje la jeringa constante durante 30 seg a 1 min a fin de evitar el trazador a fluir fuera del cerebro. </li><li> Lentamente tire de la jeringa, reubicarlo sobre el segundo agujero y repetir el mismo proceso con el 300 nl restante que están dentro de la jeringa. </li><li> Después de la segunda inyección, retire la jeringa y proceder a cerrar el que estánd con una sutura de 5-0 y añadir unas gotas de PVP-I. </li><li> Mueva el animal en una nueva jaula. No coloque animales operados con animales que aún no han sido operados. Los animales que han sido sometidos a cirugía se pueden juntar. No deje los ratones sin vigilancia hasta que estén despiertos y han recuperado decúbito esternal. </li><li> Deje que el animal se recupere durante 10 días antes del sacrificio. </li></ol> 5. Tracto trazador Observación <ol><li> Anestesiar el animal totalmente por las directrices institucionales. Confirmar la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta en la pata trasera cuando se presiona con los dedos o con un fórceps. No continúe hasta que el animal está completamente dormido. </li><li> Perfundir los animales con 4% de paraformaldehído en PBS (pH 7) bajo protocolos estándar 6. </li><li> Retire el cerebro y posterior corrección por O / N inmersión en paraformaldehído al 4%. </li><li> Cryoprotect cerebros en sacarosa al 30% hasta que el cerebro se hunden. A continuación, retire el cerebro y congelar por 10 seg inmersión en nitrógeno líquido. Mantenga cerebros a -80 ° C hasta que se producen secciones. </li><li> Producir secciones a 20 micras para el análisis trazador tracto retrógrada y de 40 micras para el análisis trazador vías anterógrada seccionando en un cryostate. </li></ol> Nota: Las neuronas FG marcado se puede observar como las células blancas bajo la luz ultravioleta de excitación. BDA es detectado por O / N de incubación con un complejo avidina-biotina-peroxidasa y 3,3 &#39;diaminobencidina con la adición de níquel al 0,4% para mejorar el contraste de las fibras de 6,7.

<ol>
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Producción y el acceso abierto tasas de publicación proporcionadas por DURECT Corporation, que produce las bombas miniosmóticas utilizados en este artículo.

Durante muchos años, la investigación sobre enfermedades neurodegenerativas como el accidente cerebrovascular isquémico o lesión cerebral traumática se ha centrado en el desarrollo de terapias neuroprotectoras que tienen como objetivo promover la supervivencia neuronal en la fase de accidente cerebrovascular agudo. La gran mayoría de las terapias de drogas que se han encontrado para ser eficaz en modelos de roedores fallidas cuando se traduce a la clínica. Las razones para este fracaso terapéutico incluyen, pero no se limitan a la falta de efectos sostenida de fármaco que resulta en la persistencia de la recuperación neurológica funcional. Por tanto, es importante desarrollar estrategias que promueven la remodelación del cerebro en el largo plazo. Debido a que la promoción de la supervivencia neuronal por sí sola no es suficiente para permitir la recuperación de accidente cerebrovascular con éxito, según lo sugerido por el gran número de ensayos de neuroprotección fallidos, la estimulación de la plasticidad neuronal ha obtenido recientemente un gran interés en el campo. Medios para la administración de fármacos son la inyección intraperitoneal, cola i intravascularnjection, inyección femoral, inyección estereotáctica simple de los vectores en el cerebro y continuado de suministro constante mediante bombas miniosmóticas. Este último puede incluir la administración sistémica, si la bomba no tiene una cánula, o que se puede-dirigió órgano, como hemos demostrado para la entrega en el cerebro. Con la excepción de las bombas miniosmóticas y el uso de vectores virales, todas las otras estrategias inducirán concentraciones de fármaco fluctuantes. Para los experimentos a largo plazo que se convierte así en necesario someter al animal a la tensión de recibir inyecciones frecuentes. La BBB impone un impedimento importante para la captación cerebral de las proteínas o fármacos de la sangre, resultando en la necesidad de proteínas o de drogas enormes dosis con el fin de conseguir concentraciones terapéuticas en el cerebro. Por ejemplo Pellegrini et al. (2013) 5 rhEpo entregado por inyección intraperitoneal a una dosis equivalente a 75 UI / día para un animal de 30 g (750 UI / día para un 300 g de rata). En comparación, la entrega de RHEP dirigidao al cerebro nos permitió utilizar una dosis mucho más baja de sólo el 10 UI / día en nuestro estudio para la recuperación del accidente cerebrovascular con éxito, lo que nos permitió lograr la recuperación en una gran escala de tiempo a una tasa fija de 0,25 l / h. En este trabajo hemos demostrado el método de implantación de minibombas con una cánula conectada al cráneo con el fin de entregar la proteína de la plasticidad de promoción rhEpo directamente en el ventrículo, eludiendo así el BBB. Mediante este método, rhEpo promueve la recuperación neurológica en un número de maneras, incluyendo la reducción del tamaño del infarto, reducción de la formación de la cicatriz glial y la inducción de la angiogénesis. rhEpo también promovió la supervivencia neuronal y el aumento de las proyecciones de la corteza motora contralesional hacia el núcleo rojo denervado y núcleos faciales. El surgimiento de las fibras fue revelado por inyección del trazador anterógrado del tracto BDA en el cortex motor (Figuras 4A y 5A). Un correlato funcional para el surgimiento de las fibras es provided por la mejora de las habilidades motoras (Figura 5B). Además, hemos demostrado que el mismo enfoque para la inyección del trazador tracto se puede aplicar para dar a conocer las conexiones tálamo-cortical por inyección del trazador FG retrógrada del tracto (Figura 6B). En la preparación de la bomba miniosmótica, es fundamental tener en cuenta el punto de destino y el uso de espaciadores. Utilizamos un espaciador para reducir la longitud de la aguja de 0,5 mm como de esta manera la punta de la aguja está en contacto con el ventrículo en las coordenadas dadas (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateral, 2.5 mm dorso ventral, con respecto a bregma). Sin embargo, si las estructuras más profundas son el objetivo de la investigación, entonces no se necesitarán espaciadores. Del mismo modo, si se desea un punto de entrega más externa (es decir., La corteza), será necesario entonces más discos espaciadores. El catéter debe ser lo suficientemente largo para que la bomba no está demasiado cerca de la cabeza, ya que impedirá movimientos del mouse, sino también la longitud excesiva no demasiado largo ya que una vez implantado puede hacer que el catéter se doble, lo que aumenta el riesgo de eliminación de la cánula por el movimiento natural del ratón. Una sección de 2 cm de catéter da muy buenos resultados en términos de movilidad y estabilidad del implante (Figuras 1 y 2). La incubación de la bomba a 37 ° CO / N permite que la bomba para iniciar de inmediato el bombeo de la droga en el cerebro en el momento de la implantación. En la implantación de la bomba miniosmótica es crítico para asegurar que el cráneo se seca adecuadamente antes de la implantación de la cánula. Por lo general, la limpieza con 70% de etanol inducirá el hueso para secar, pero si se encuentra sangrado continuo, tocando el cráneo suavemente con un cauterizador se seque completamente. Es crítico para asegurar que la introducción de la aguja es tan vertical y lenta como sea posible. Una vez en posición, y mientras el pegamento se está secando, colocando el dedo en la parte superior de la cánula impide que se mueva hacia los lados over el cráneo. Especial cuidado se debe dar a la herida y la colocación de la cánula. Es importante que la incisión no se realiza exactamente sobre la línea media del cráneo, pero ligeramente hacia el lado derecho. Al cerrar la herida, si la incisión fue hecha en la línea media, la piel estará sobrecargado, lo que aumenta el riesgo de la apertura de la herida. Hacer la incisión ligeramente hacia un lado permitirá que los puntos de sutura para estar lejos de la parte más alta de la cánula. Como consecuencia habrá menos tensión en los puntos de sutura y la herida se cure adecuadamente. Los animales deben ser enjaulados solo y comprobar todos los días, especialmente durante los primeros 10-15 días después de la implantación. En caso de dehiscencia de la herida, heridas tienen que cerrarse tan pronto como sea posible. Si la cánula es retirado o el animal presenta una infección, el experimento tiene que ser terminada. No se recomienda la reimplantación de la cánula. Es muy importante para la implantación exitosa de usar cantidades adecuadas de tejido adadhesivo (no demasiado!) ya que se degrada el hueso y aumenta el riesgo de eliminación de cánula. Sin embargo, utilizando muy poco adhesivo también no sostendrá la cánula unida al hueso. Las bombas miniosmóticas pueden transportar medicamentos disueltos en una amplia variedad de sustancias, siendo la única limitación a esto que el disolvente es biocompatible. Además, dado que el volumen es pequeño (200 l), uno debe determinar si la concentración requerida para el experimento es adecuado y no provocar la precipitación dentro de la bomba. Tracto rastreo, ya sea con anterógrada o retrógrada trazadores es una técnica muy bien establecida para estudiar la conectividad cerebral y la plasticidad. Se debe tener en cuenta los marcos de uso estereotáxica al inyectar para asegurar la precisión en la orientación de la zona del cerebro que se desea estudiar (es decir, para evitar la inyección en el cuerpo calloso cuando se inyecta la corteza). Para todas las intervenciones quirúrgicas y con el fin de reducir el dolor yinflamación, los animales deben ser tratados con 0,1 mg / kg de buprenorfina antes de la intervención y Caprofen a 4 mg / kg una vez al día durante tres días después de la intervención. En conclusión, este enfoque proporciona una herramienta adecuada para el estudio de efecto de las proteínas o compuestos farmacológicos en el cerebro lesionado, lo que representa un método que es muy adecuado para estudios sobre la plasticidad del cerebro.

The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7. 
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Alzet miniosmotic pump. Model 2004.</td>
			<td style="width:115px;">Alzet</td>
			<td style="width:119px;">000298</td>
			<td style="width:183px;">Drug container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Brain infusion kit 3 1-3mm</td>
			<td style="width:115px;">Alzet</td>
			<td style="width:119px;">0008851</td>
			<td>Drug brain delivery system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:272px;">Loctite&#160; 454 Prism gel&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Loctite</td>
			<td style="width:119px;">45404</td>
			<td style="width:183px;">Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">75N glass syringe&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">87900/00</td>
			<td>Injection of tract tracers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Biotin Dextran Amine (10000 MW)</td>
			<td style="width:115px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;">N-7167</td>
			<td>Anterograde tract tracer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Fluorogold</td>
			<td style="width:115px;">Fluorochrome, LLC.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Retrograde tract tracer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td>
			<td style="width:115px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">53311</td>
			<td style="width:183px;">Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.</td>
		</tr>
	</tbody>
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implantation of miniosmotic pumps and delivery of tract tracers to study brain reorganization in pathophysiological conditions

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.

Presentamos los animales a los 30 min de oclusión de la arteria cerebral media por el método de sutura intraluminal inducir una lesión en el cuerpo estriado izquierdo y luego entregado rhEpo directamente en el cerebro por medio de bombas miniosmóticas (Figura 1, Figura 3) durante 30 días a partir de 3 días después accidente cerebrovascular 6. La Figura 4 muestra un esquema del tracto espinal cortico que fue rastreado después de CB y BDA inyección y el área donde se inyectaron trazadores. Nos mostró una mejora de la fuerza de agarre y el rendimiento del motor (Figura 5) después de 14 y 42 días de entrega rhEpo respectivamente. Entrega de BDA en el cortex motor derecho de los animales que recibieron un golpe en el cuerpo estriado izquierdo, mostró un aumento en fibras motoras de cruzar la línea media a nivel del núcleo rojo y facial (Figura 5), lo que demuestra la tinción con éxito de la germinación fibras como consecuencia del tratamiento farmacológico con miniosmotBombas ic. tratamiento rhEpo también aumentó la supervivencia neuronal, retraso astrocitosis difusa, reduce la formación de cicatriz glial y el aumento de la angiogénesis en el período estudiado 6. Mediante el uso de esta misma técnica para la inyección del trazador tracto podemos detectar con éxito núcleos talámicos que están conectados a la corteza mediante la inyección de la retrógrada trazador FG tracto (Figura 6). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig1.jpg" /> Figura 1. Componentes de la bomba miniosmótica utilizado en este protocolo. El disco espaciador, cánula y pestaña desprendible, catéter, flujo moderador y bomba miniosmótica se pueden observar. El aspecto de la bomba completamente montado se puede ver en la figura 2A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> entro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig2.jpg" /> Figura 2. Resumen de los puntos clave de implantación de la bomba. (A) El ratón se muestra como se coloca en el dispositivo estereotáctica con la bomba miniosmótica totalmente construido al lado de él. La flecha indica las coordenadas seleccionadas para la implantación. (B) La bomba se ha introducido en la parte posterior del animal y sólo la cánula permanece en el exterior. El cráneo ya ha sido perforado. (C) Aspecto de la cabeza después de la implantación. (C.1) La cánula está en posición, pero la pestaña extraíble no ha sido cortada. (C.2) La pestaña extraíble ha sido cortado y cosido de la herida puede ahora comenzar. (D) El asterisco muestra un animal recientemente implantado en comparación con un animal 30 días después de la implantación (#). Cuando ubicado correctamente, la herida debe permanecer cerrada hasta el final del procedimiento, como se muestra en la imagen.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig3.jpg" /> Figura 3. tinción de Nissl que indica el lugar del implante en la corteza. Una pequeña incisión se puede observar en la parte de la corteza izquierda (flecha). La anchura de la zona penetrado es de aproximadamente 50 micras. La hay evidentes graves alteraciones de los tejidos basado en tinción de Nissl en comparación con la zona contralateral correspondiente (*). R: hemisferio derecho. L: hemisferio izquierdo. Barra de escala = 300 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig4.jpg" /> Figura 4. Tractoestrategia de inyección de trazador como publicado antes por Reitmeier et al. 6,7. (A) los sitios de inyección que indican esquemáticos para el trazador tracto BDA en la corteza motora contralateral mientras que CB se inyectaron en la corteza motora del hemisferio infartado. Las fibras se siguieron hasta el núcleo rojo (no mostrado) y el núcleo facial (véase la Figura 5). (B) El sitio de la inyección del trazador anterógrado del tracto BDA al lado de la corteza motora se muestra. Tenga en cuenta la flecha roja que indica el trayecto de la aguja mientras que la flecha negro muestra algunas células corticales etiquetados con el BDA. Cx: Corteza. CC: cuerpo calloso. V: ventrículo. FN: núcleo facial. Barra de escala en B = 200 micras. Figura 4A se reproduce con el permiso 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 5&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52932 / 52932fig5.jpg&quot; /&gt; Después se detecta la Figura 5. Recuperación de un cerebro infartado después de la entrega de rhEpo. (A) BDA inyecta en la corteza motora contralesional en fibras corticobulbares a nivel del núcleo facial (Bregma -5,8 mm a -6,3 mm). Líneas de intersección de cada hemisferio se elaboraron en paralelo a la línea media y fibras que cruzan cada línea en dirección al hemisferio ipsilesional y contralesional se contaron y se expresó como porcentaje de fibras marcadas totales en el tracto corticoespinal. La eritropoyetina aumentó cruces de fibra en la dirección de los contralesional faciales Datos núcleo son medios + - SD. Los datos fueron analizados por ANOVA de una vía seguida por menos pruebas de diferencias significativas, §p &lt;0,05 en comparación con los ratones no isquémicos tratados con vehículo. (B) Comportamiento Motor mostró una mejora de fuerza de prensión manual y la coordinación en la prueba de varilla rota. Los datos son medias values + - SD. Los datos fueron analizados por medidas repetidas de dos vías ANOVA, seguido de un modelo lineal / menos significativos pruebas de diferencias para cada punto de tiempo. §p &lt;0,05 en comparación con la línea base pre-isquémica; * P &lt;0,05 en comparación con los ratones isquémicos tratados con vehículo. Figuras 5A y B se reproducen con el permiso 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig6.jpg" /> Figura 6. estructuras de destino alcanzada después de la inyección de Fluorogold (FG). (A) el lugar de inyección de FG al lado de la corteza motora, como se indica en la Figura 1. Nota la flecha roja indica el trayecto de la aguja y la flecha blanca indica unas pocas células marcadas en la corteza. (B) FG inyecta cerca del motorse detecta la corteza en el VPL. Fi: Fimbria. IC: cápsula interna. RT: núcleo reticular talámico. VPL: talámico núcleo ventral posterolateral. Barra de escala = 200 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Implantación de miniosmótica Bombas y Entrega de Trazadores del Tracto para estudiar la reorganización del cerebro en condiciones fisiopatológicas

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