Name: planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00
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The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.

Mold Design 1. 3D e Peças <ol><li> Mofo <ol><li> Antes de trabalhar, obter um kit de elastômero de silicone, uma câmara de imagens de células vivas, uma lamela de vidro 22 mm, e um cubo de metal de alumínio usinado com dimensões 10,07 milímetros x 3,95 milímetros x 5,99 milímetros. Preparar a câmara de imagem de células vivas para moldagem, colocando a lamela inferior no suporte de montagem e o resto da câmara, conforme indicado pelo fornecedor. </li><li> Em seguida, usando uma pinça, coloque o cubo de al...

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Methods. 180 (2), 193-211 (1995).</li><li>Sundd, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+paxillin+in+rolling+neutrophils+by+dual-color+quantitative+dynamic+footprinting.">Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting.</a> Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Volume+Transfers+with+Serological+Pipettes+and+Micropipettors.">Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors.</a> J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).</li><li>Stephenson, F. 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Os passos mais críticos para as experiências bem-sucedidas de difusão com ou sem células são: configurar corretamente o conjunto de molde; desenvolver a destreza manual necessário para evitar danos durante a extracção de lamelas hidrofóbicos; garantindo a encontrar uma linha muito boa de partida linear para calcular correctamente o coeficiente de difusão; corrigir cálculos experimentais de colagénio e quimioatractiva; usar corretamente do sistema de imagens de células vivas para garantir matriz não secar; ...

A deslocação preferida de células para um gradiente de concentração, conhecido como quimiotaxia, desempenha um papel importante em processos fisiológicos e patológicos no organismo. Tais exemplos são a pele e mucosa 1 a cicatrização de feridas, a morfogénese 2, 3 inflamação, e 4,5 o crescimento do tumor. Também tem sido mostrado que as células cancerosas podem migrar através de duas estratégias individuais e colectivos-migração celular 6. Além disso, os mecanismos de difusão de instabilidade pode induzir a separação de células individuais ou agrupados a partir de um corpo / objeto tumoral e, em seguida, podem emigrar para uma fonte de nutrientes e, portanto, invadir áreas mais largas e 7 tecidos. Além disso, foi demonstrado que diversos mecanismos de migração podem ser activa em 2D e em 3D, devido a diferentes funções de moléculas de adesão 8. Portanto, um movimento para fisiologicamente relevante em ensaios in vitro para investigar a motilidade celular em um measureable de modo simples e é de importância na compreensão de fenômenos movimento de 9 células. Infelizmente, a dificuldade em analisar a migração de células, um ensaio de quimiotaxia quantificável abrangente geralmente requer um método trabalhoso longo, fundada na medição da motilidade celular e fenômenos de transporte modelos imparciais. Abordagens experimentais passadas para investigar quimiotaxia de células incluem a câmara de Boyden 10 eo ensaio sob agarose 11. No entanto, dentro destes primeiros ensaios, as experiências de migração de células não acompanhar o movimento em relação ao tempo. Mais, o mais importante, os gradientes de concentração utilizados para as experiências não foram bem definidas ou completamente compreendido, enquanto apenas para sustentar a sinalização para não mais do que algumas horas. Além disso, as tentativas de câmara de quimiotaxia precoce restrito a migração de células para duas dimensões e não permitem controlar a cinética da migração 12. Olhando para a câmara de Boyden, um ensaio endpointnão permitiria ao pesquisador observar visualmente a migração e não poderia diferenciar diretamente quimiotaxia (movimento direcional) de quimiocinese (movimento aleatório). Além disso, várias variáveis ​​diferenças no tamanho de poro e espessura de membranas feitas a câmara muito difícil de reproduzir de forma fácil e oculta a reacção migrante de células para quimiocinas 13,14. Com o novo entendimento de microfluídica, novas câmaras e micro-dispositivos têm sido investigados como um instrumento para investigar a locomoção de células sob condições de fluxo intersticiais ou quimiotaxia 15,16. De acordo com estes novos dispositivos, novas métricas de células foram introduzidos e investigados, como o efeito da tensão de cisalhamento em uma célula 17,18. Infelizmente, câmaras de quimiotaxia microfluídicos passadas e atuais limitam estudos de migração celular para substratos um 2D revés importante, pois muitos processos biológicos, incluindo a invasão de células de tumores e metástases, e immigração celular Mune, envolvem a migração 3D. Câmaras-onde a observação direta de uma solução chemoattractant está em contacto com um gel 3D contendo células também têm sido também relatados 19,20. Estas câmaras têm dois compartimentos, um contendo um quimioatractor e uma contendo células, são unidas ao lado uma da outra na horizontal 21 ou como anéis concêntricos 22. Estes sistemas são apontados na direção certa, mas não manter um sistema de quimiotaxia por um período prolongado de tempo. Além disso, os investigadores examinaram também difusividade através de membranas de colagénio em células de diálise, bem como a difusão de moléculas marcadoras através de amostras de colagénio submetido a pressão hidrostática 23-25. Algumas experiências de difusão em géis de colagénio dependem de alterações físicas e químicas do gel usando campos magnéticos e incorporação química 26. Um método popular para a modelagem diffusivity em collatecidos endógenos baseia-se na imagem de fluorescência de ponto fotodegradação contínua. Este método revelou anisotropia nos coeficientes de difusão de macromoléculas em tecidos de colagénio orientadas. No entanto, a fotodegradação foi usado na cartilagem articular e não matrizes de colagénio. Embora semelhantes, os experimentos de modelagem necessárias devem ser realizadas através da compreensão especificamente o coeficiente de difusão de géis de colágeno. Mais importante ainda, os sistemas não utilizam um método para medir a força de geração de células. Infelizmente, a maioria dos sistemas parecem estar faltando um ou dois elementos-chave para um sistema ideal: o que permite rastreamento de celular, uma compreensão gradiente de difusão com um fator quimiotático através da matriz, um conjunto relativamente simples com uma facilidade de reprodutibilidade, a minimização de célula-célula interações, e a capacidade de medir unidades dimensionais para quantificação (isto é, velocidade, força, concentração específica). Moghe et ai. </em&gt; 27 proposto um sistema que cumpriu a maioria destas exigências em que as células foram inicialmente dispersos por todo o gel em vez de concentradas na superfície do filtro, mas foi difícil de medir as forças que a célula gera. Para este fim, apresentamos um sistema de gradiente de difusão planar para investigar quimiotaxia em uma matriz de colágeno 3D, que permite superar as limitações modernas câmara de difusão de ensaios existentes, que é baseado na microscopia de lapso de tempo, juntamente com técnicas de análise de imagem para medir celular forças em um ambiente 3D. Este protocolo proporciona uma maneira simples, contudo inovadora de criar uma câmara de difusão 3D simples que pode ser utilizado para investigar a quimiotaxia 3D em células diferentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td>
			<td>a two-part misture with a 10:1 mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>CM-B18-1</td>
			<td>CMB for 18mm round coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22mm Glass Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0180281</td>
			<td>Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machined aluminum metal cube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hobby utility knife</td>
			<td>X-Acto</td>
			<td>X3201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(aminopropyl) trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>00216A-10</td>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Standard floor model and tabletop centrifuges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
			<td>Fine Point Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-105A</td>
			<td>Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Acetic acid ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090</td>
			<td>Hexane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-precision diamond scribing tool</td>
			<td>Lunzer</td>
			<td>PV-081-3</td>
			<td>Straight extended tip scribe, .020&#34; (.50mm) diameter by .200&#34; (5.0mm) tip length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5C</td>
			<td>High-Vacuum Grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X phosphate buffered solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-500</td>
			<td>1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1N sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38215</td>
			<td>Sodium hydroxide concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-332</td>
			<td>Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;F-8813</td>
			<td>Carboxylate-modified microspheres, 0.5 &#181;m, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83689</td>
			<td>Rhodamine B for fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

A capacidade do presente ensaio para avaliar com precisão a migração da célula depende de uma boa configuração do sistema. Portanto, é crucial para certificar-se de projetar o molde sistema de difusão de forma precisa e tomar muito cuidado na colocação de lamelas de ambos hidrofóbicos e hidrofílicos, como ilustrado na figura 1. Se o sistema for projetado corretamente e durante a etapa de modelagem difusão garantindo para encontrar um muito boa linha de partida linear, uma é capaz de alcan?...

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Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Bioengenharia

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Sistema de Gel Concentric para estudar o papel Biofísica da Matrix Microenvironment sobre a migração celular 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...