Name: trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Line Generation <ol><li> Generera två olika konstruktioner. I den första konstruktionen är RpL10A cDNA (ribosomala proteinsubenhet L10a) klonad nedströms GFP i pUASP-PL-GFP-nter plasmid (modifierad version från 32). Användningen av en bakterielinje-promotor medger en mer flervärd användning av den transgena linjen. OBS: Skaffa den andra konstruktionen genom att klona den regulatoriska sekvensen kör vävnadsspecifika uttryck av slöfock genen uppströms GAL4 (TF) med hjälp av pPTGAL4 plasmid. </li><li> Injicera plasmider separat in w 1118 flugor och infoga konstruktionerna i farten genomet av P-elementet inser (enligt standardprocedur) 33. </li><li> Välj transformanter i syfte att utvinna fluglinor med konstruktioner på två olika kromosomer. Den slutliga TRAP linje skapas genom att kombinera dessa två linjer (genetiska korsningar) för att få en dubbeltransgena stabil linje. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx v-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massively förstärka denna linje och samla önskad-iscensatta embryon. </li></ol> 2. Embryo Collection <ol><li> Förbered 8 stora cylindriska befolkningen burar som innehåller cirka 40 g av unga flugor per bur (cirka 180.000 flugor / bur). </li><li> Fortsätt med så kallade pre-Lays som tillåter flugor för att rensa utvecklings embryon från sina äggledare. För att lägga flugor för 1 timme på två 11 cm diameter petriskålar innehållande en blandning av stelnat agar och druvsaft och täcka ⅓ av ytan med nyligen gjort jäst pasta. Efter 3 utbyten av druvjuice plattor samla de verkliga embryon på liknande nybakade plattor. OBS: Inkubationstiden varierar i enlighet med utvecklingstidsfönster studeras. </li><li> Ta bort plattorna från burarna och lämna dem vid samma temperatur under den tid som behövs för att få rätt utvecklingsstadium (t.ex. 3 h ägg-läggning + 10 timmar av additional inkubation ger embryon från scenen 10-13 timmar efter äggläggning (AEL)). Resuspendera plattan innehåll (embryon, jäst pasta, döda flugor) med 50 ml vatten med hjälp av en borste. </li><li> Gå igenom en serie siktar (700 pm, 355 pm, 112 pm) för att åtskilja embryon från döda flugor och övriga kroppsdelar och samla embryon förvaras sikt med mindre diameter, sedan tvätta snabbt i avjoniserat vatten. Använd inte mer än 18 plattor per samling eftersom det kan täppa till silar. </li><li> Dechorionate embryon i 4,5% blekmedel i avjoniserat vatten för 2 minuter och skölj noggrant med avjoniserat vatten för 30-60 sekunder. Inkubera embryon i PBS 0,01% Tween 20, 100 | ig / ml cykloheximid, under 5-10 min vid RT under omrörning. </li><li> Torra embryon på cellulosa absorberande ark och överföra dem till mikrocentrifugrör. Väg rören och blixt-frysa embryona genom nedsänkning i flytande kväve. I detta skede kan de torkade embryona lagras under flera månader vid -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Framställning av magnetiska pärlor kopplade till GFP-antikropp <ol><li> Grundligt resuspendera Protein G magnetiska kulor i originalförpackningen genom försiktig omrörning. </li><li> Transfer 90 il pärlor till en RNas-fri rör och samla dem på en magnet (30-60 sek). 90 pl av pärlor är nödvändig för att utföra immunoprecipitation (IP) med 1 ml lysat innehållande 60-80 mg / ml proteiner. Respektera förhållandena att förhindra vulst mättnad. Använd flera rör enligt proteinmängden. </li><li> Tvätta pärlor med 1 × PBS 0,01% Tween 20 (500 pl) och samla pärlor på magneten för att kassera supernatanten. Lägg 30 ^ g av GFP-antikropp i 350 ul PBS 0,01% Tween 20 till pärlorna och inkubera med långsam ände över ände blandning under 30 min vid RT. </li><li> Samla pärlor på magneten (30-60 sek), kassera supernatanten och skölj i 500 fil polysom ​​extraktionsbuffert (HEPES 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, cykloheximid 100 | ig / ml , Protease inhibitor 1 ×, RNas inhibitor 100 U). </li><li> Samla pärlor på magneten och tillsätt 500 | il blockerande buffert (BSA 0,1 mikrogram / l, jäst tRNA 0,1 mikrogram / l, glykogen 0,1 mikrogram / l i polysom ​​extraktionsbuffert). </li><li> Inkubera under 30 min vid RT och upprepa detta steg en gång med färskt blockeringsbuffert. </li><li> Samla pärlor på magneten och skölj i 500 fil polysom ​​extraktionsbuffert, sedan minnas pärlor och gå direkt till immunorening steget (avsnitt 6). </li></ol> 4. Lysat Framställning <ol><li> Innan du börjar, ställa in programmet på flera riktningar snabb hastighet pärlor grinder: 2 x 10 sekunder vid 5000 rpm, 15 sek paus. Överför torkade embryon (1,5 g) och 15 ml rör förkyld på is innehållande polysom ​​extraktionsbuffert, och homogenisera omedelbart. Homogenisera 1,5 g embryon i 4 ml polysom ​​extraktionsbuffert. </li><li> Sprid homogenis embryon i två kyld 2 ml rör och slipa embryos genom att köra homogenisator programmet. Överför lysatet till färska förkyld mikrocentrifugrör på is och förbereda en nukleära överstående lösningen genom centrifugering vid 4 ° C under 10 min vid 2000 g. </li><li> Överför supernatanten till ett nytt förkyld mikrocentrifugrör på is, tillsätt 1/100 prowolymen av 10% Nonidet P-40 till supernatanten (slutkoncentration = 0,1%), och blanda det försiktigt genom att vända röret. </li><li> Puls-centrifug provet i en minifug att samla vätskan vid botten av röret, tillsätt 1/9 prowolym av 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DHPC) (slutkoncentration = 30 mM ), blanda det försiktigt genom att vända röret, och inkubera blandningen på is under 5 min (blandning genom att vända flera gånger under inkubation). </li><li> Förbered postmitokondriella supernatanten genom centrifugering vid 4 ° C under 10 min vid 20 tusen g. Mät proteinkoncentrationen genom Bradford-metoden: koncentration i lysat bör vara mellan 60-80 mg / ml. Take supernatanten till en ny fräsch förkyld mikrocentrifugrör och fortsätt omedelbart före absorptionssteget (avsnitt 5). </li></ol> 5. Pre-absorption <ol><li> Grundligt resuspendera de magnetiska pärlorna genom försiktig omrörning och överföra 30 fil av pärlor i ett mikrocentrifugrör vid RT (30 pl pärlor / 1 ml embryonala lysat). </li><li> Samla pärlor på magneten, pipett bort supernatanten och resuspendera pärlor i polysom ​​extraktionsbuffert (500 l). Samla pärlor på magneten, till embryonala lysat, och inkubera i 1 timme vid 4 ° C på en rotator. <ol><li> Ta pärlor och hålla supernatanten på is för immunorening steget. Före immunorening, hålla 100 pl supernatant (input) för att jämföra den globala RNA-prov med RNA-prov som tagits efter immunorening, genom RT-qPCR till exempel. </li></ol></li></ol> 6. immunorening <ol><li> Tillsätt 1 ml (motsvarande 60 till 80 mg / ml protein) avförabsorberades lysatet till en RNas-fri rör innehållande 90 | il av blockerade pärlor kopplade till GFP-antikropp. Inkubera proverna vid 4 ° C under 2 h med försiktig ände-över-ände blandning i ett rör rotator. Alternativt, utföra inkubationen O / N vid 4 ° C. </li><li> Efter inkubation, samla pärlor på magneten. Använd en minifug att centrifugera ner kulorna, därefter återsuspendera dem i 500 | il tvättbuffert (HEPES 10 mM, KCl 350 mM, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cykloheximid 100 | ig / ml, RNas-inhibitor 100 U ) och samla dem på magneten. Upprepa detta steg två gånger till. </li><li> Ändra pärlorna till en ny förkyld RNas-fri rör och tvätta två gånger. Samla pärlor på en magnet och gå vidare till RNA-extraktion genom att tillsätta 1 ml Trizol direkt till pärlorna och följ tillverkarens instruktioner. </li></ol> 7. RNA Clean-up och kvalitetsbedömnings- <ol><li> Använd en RNeasy Micro kit enligt tillverkarens anvisningar. I efterhand, elute RNA med (x) | il RNas-fritt vatten. Varm för 2 min vid 60 ° C, och lagra snap frysta prover vid -80 ° C. Kolla RNA kvalitet med hjälp Bioanalyzer (följ tillverkarens instruktioner). </li><li> För att testa specificiteten hos Traped RNA, utföra omvänd transkription på 3 ng renat RNA (ingång och IP) enligt tillverkarens instruktioner (upphöjda III). Använd cDNA som erhållits för qPCR användning av genspecifika primeruppsättningarna. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Detta dokument beskriver en modifierad Översättning Ribosom Affinity Purification protokoll (kallas &quot;TRAP-rc&quot;) ägnar sig åt studier av sällsynta cellpopulationer i Drosophila embryon. Information ges om de viktigaste stegen för framgångsrik isolering av specifik RNA med en avkastning som är lämpliga för microarray eller RNA-punkter analys, det vill säga 1) mängden biologiskt material som krävs och optimerad procedur för embryo lys och polysom ​​extraktion; 2) pärlor / antikropp-to-lysat förhållanden för optimal immunoprecipitation; 3) steg tillåter minskning av bakgrunds inklusive tvättbuffertsammansättning för att köra TRAP-rc experiment med hög specificitet och sensitivitet. Detta protokoll ger reproducerbara uppgifter som gör det lätt tillämpas på andra celltyper. Denna teknik gör det möjligt att analysera differentiell genuttryck i nivå med aktivt-översätta mRNA och därmed bana väg för att förstå proteinuttryck i en spec<html> IFIC celltyp vid en specifik tid. Observera dock att protein överflöd beror på graden av översättnings- och nedbrytningsprocesser. En viktig begränsning av TRAP-metoden är dess oförmåga att mäta proteinhalten i ett exakt kvantitativt sätt eller för att upptäcka posttranslationell modifiering. Att förbättra kvantifiering genom att mäta ribosomen täthet längs mRNA kroppen och därigenom i en cell-typ-specifikt sätt kan göra TRAP i kombination med ribosomen footprint ett mycket kraftfullt verktyg. I en nyligen papper 34, var denna kombination utförs i humana embryonala njur-293-celler. Författarna sprang nukleas footprints följt av affinitetsrening av en inducerbar biotinylerad form av RpL10A använder streptavidinpärloma. Detta är ett bevis på principen att det är möjligt att utföra ribosomen footprints i en hel organism samtidigt rikta en viss celltyp, begränsningen är mängden biologiskt material som krävs för ändamålet. &quot;&gt; Utföra TRAP experiment parallellt med globala transcriptomic analyser kommer att göra det möjligt att spåra proportioner mellan nyligen transkriberas och actively- översätta RNA. Detta kommer att vara djupt informativ om de potentiella posttranskriptionell mekanismer som äger rum i särskilda utvecklingssammanhang eller specifika cellpopulationer -Genom mikroRNA till exempel. Sammanfattningsvis är TRAP en mycket effektiv, specifik och känslig metod för att identifiera RNA bundna till aktivt-översätta ribosomer i ett cellspecifikt sätt. Denna metod kan användas i ett stort antal olika organismer och vävnadstyper. Den nya TRAP-rc protokoll som beskrivs här var optimerad för sällsynta cellpopulationer (mindre än 1% av det totala antalet celler) och en mängd färdiga materialet tillräckligt för efterföljande analyser på hel-genomnivå. En möjlig begränsning med denna metod är kravet på en stark drivkraft för att producera märkta ribosomer i tillräcklig mängd för att compete med endogena omärkta dem i riktade celltyp. I en nyligen genomförd studie 25, författare uppskattas till 10-30% förhållandet taggade kontra omärkta ribosomer. För att lösa detta problem ökar UAS-RpL10A-EGFP antal kopior bör avsevärt förbättra denna balans. Alternativt kommer att lägga till den beskrivna genetiska bakgrunden en UAS-GAL4 transgen förstärka produktionen av GAL4 protein och indirekt öka uttrycket av RpL10A-EGFP. Detta bör gynna en bättre beläggning av märkta ribosomer på mRNA. Observera att kan göras detta redan effektiv strategi ännu kraftfullare genom att anpassa kompletterande metoder för att få en mer kvantitativ aspekt eller för att upptäcka och avslöja molekylära mekanismer som är nödvändiga för genuttryck kontroll.

Att förstå hur celler förvärvar specifika egenskaper under utveckling är avgörande för att uppskatta komplexiteten av organ och deras potentiella utveckling mot patologiska tillstånd. Det finns en stor forsknings tryck att dechiffrera genreglerande nätverk som underliggande fastighets cell specifikation och differentiering av unrevealing globala genuttrycksprofilerna, Pol II bindande status, transkriptionsfaktor beläggning på regulatoriska sekvenser eller posttranslationella modifieringar av histoner. För att bedöma genuttryck på global nivå mikroarrayer och RNA-punkter metoder används. Microarrays gör det möjligt att upptäcka mRNA överflöd, medan RNA-punkter är bättre rustad att informera om de olika typer av RNA, inklusive kodning och icke-kodande RNA som mikroRNA, lncRNAs eller snRNA. Dock kan dessa tekniker inte särskilja aktivt transkriberade, steady-state mRNA, aktivt-översättning mRNA och mRNA in i nedbrytningsprocessen. Mätt steady-ståt mRNA-nivåer är känd för att vara en dålig uppskattning av proteome komposition 1-3. I motsats, identifiera aktivt-översätta mRNA ger en mer rättvisande bild av proteinproduktion. Dock har transcriptomic studier främst drivits på hel-organismnivå genom att jämföra vinst eller förlust av funktion av en specifik faktor för vildtyp tillstånd 4-7 eller dissekeras vävnad, vilket gör genuttrycksprofilerna svåra att tolka. Nya framsteg i cellinriktningsverktyg, affinitetsrening och känslighetsförbättringar tillåter nu att utföra genomtäckande analyser av små cellpopulationer eller ens enskilda celler i en levande organism. I Drosophila, stora samlingar av transgena linjer aktivera det specifika tid och rum inriktning av olika vävnader och cell subpopulationer via GAL4 / UAS systemet 8-10 ger mer exakt kvantifiering av de molekylära mekanismer som krävs för cellfunktion. 11. Denna metod baserad på sackarosgradientcentrifugering möjliggör val av polysom ​​fraktionen och bestämning av mRNA översatt genomet täckande vid analys med mikromatriser eller djup sekvensering. Polysom ​​isolering kan kopplas med nukleasklyvning att identifiera ribosomala fotspår motsvarande RNA-fragment som skyddas av ribosomerna under översättningsprocessen 12. Ribosomal footprints ökar noggrannheten för kvantifiering av RNA översättning och RNA-sekvens-nivå upplösning och ribosomen positionering, gör det möjligt att mäta graden av översättning. Men hittills har det inte tillämpats på cellspecifik isolering av translatomes, främst till följd av den kraftiga minskningen av RNA erhållna utbytet vid slutet av ribosomen footprints processen. Med tanke på att storleken valet av RNA kan generera potentiella falskt positives från olika RNP som också skulle kunna skydda RNA på ett liknande sätt, är ytterligare utveckling för att förbättra ribosomala fotavtryck och anpassa den till cellspecifika strategier. En av dessa metoder, som kallas Översättning Ribosom Affinity Purification (TRAP) har beskrivits i 2008 av Heiman et al. och tillämpas för att isolera translatome från en undergrupp av neuroner i möss. Genom epitop märkning ett ribosomalt protein i en cell-typ-specifikt sätt, kan polysomer selektivt renas utan den arbetskrävande steget att cell dissociation och sortering. I det här fallet var de 60S ribosomalt protein L10a vid ytan av ribosomen taggade med EGFP 13. Sedan 2008 har flera studier använt denna metod i olika arter, från möss 14-19 till X. laevis 20,21, zebrafisk 22,23 och Arabidopsis thaliana 24. TRAP metoden har också anpassats för att Drosophila-modellen och används för att purify celltyp-specifika mRNA från nervceller 25 och astrocyter 26. Den mångsidiga binära GAL4 / UAS system användes för att uttrycka GFP-märkta RpL10A på ett vävnadsspecifikt sätt. Cheferna för vuxna flugor dissekerades att utföra polysom ​​urval från nervceller (riktade av pan-neural Elav-Gal4 förare) och isolerade RNA sekvenserades. Det stora antalet up-reglerade gener motsvarade de som är kända för att uttryckas i nervsystemet, vilket visar att inställningen har god specificitet och föranledde oss att göra det sällsynta cellpopulationer (mindre än 1% av celler) förekommer i utvecklings Drosophila embryon . Inom Drosophila modellen är i fosterstadiet en modell av val för att studera utvecklingsprocesser, som de molekylära aktörer och morfogenetiska rörelser evolutionärt bevarade. De enda vävnadsspecifika transcriptomic metoder som hittills genomförts i denna modell har utförts med hjälp av cell eller kärn sårting och har bara kunnat studera steady-state transkriptom 27-31, vilket skapar ett behov av metoder avsedda för vävnader / cellspecifik translatome profilering i gylfen embryot. Här rapporterar vi den första TRAP protokollet tillägnad Drosophila embryon. Med denna metod, som bedriver-i-translation-mRNA i en mycket begränsad cellpopulation på cirka 100 muskelceller per embryo lyckades isolerades med hög kvalitet och specificitet. Den binära GAL4 / UAS system används för att driva uttrycket av GFP-märkta RpL10A i subpopulationen av muskler utan någon toxicitet, inga uppenbara fenotyper eller utvecklingsförsening som visats tidigare 25. Drosophila embryon besitter 30 muskler per hemisegment som kommer att ge upphov till muskulaturen av larven. Genom att använda en regulatorisk region upptäcktes i närheten av slöfock identitets genen, 6 av de 30 fler kämförsedda muskler är riktade. I denna analys är ribosomer immobiliseras på mRNA med användning av översättnings töjninginhibitor cykloheximid. Cytosolextrakt används sedan för affinitetsrening med GFP-antikropp-belagda magnetiska pärlor. Kvaliteten på renat RNA validerades med Bioanalyzer. Kvantitativ omvänd transkription-PCR (RT-qPCR) användes för att bestämma specificiteten och känsligheten för mRNA-isolering och visade att vår optimerat protokoll är mycket effektiv.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Drosophila embryonala somatiska muskelsystemet består av 30 muskler per hemisegment, och varje muskel har en specifik uppsättning egenskaper: kod identitets gener, position, antal fusionshändelser, fästplatser och innervation. Identifiera översatt mRNA i ett visst muskelgrupp kommer att ge information om de proteiner som krävs för att bilda dessa specifika muskelegenskaper. Använda TRAP-baserad metod, RNA från en subpopulation av muskler som uttrycker identiteten genen slöfock renades (Figur 1A-B). En viktig fråga för detta tillvägagångssätt är kvaliteten och specificitet isolerade RNA. Den optimerade protokollet redovisas här möjlig systematisk återvinning av hög kvalitet RNA bedömas Bioanalyzer analys. Profil erhållna visar ingen nedbrytning av RNA (Figur 1C). I andra studier har utvecklats omkring TRAP metoden, var frågor som tas upp under specificiteten av uppgifterna. Här har vi improve metoden för att undertrycka bakgrunds kopplade till icke-specifik bindning av RNA till pärlorna eller rören och genom optimering av tvättbufferten. För att bedöma bakgrundsnivån och effektiviteten i isolering slöfock-uttryckande celler, ledde vi RT-qPCR försök på 3 replikat av samma fosterstadiet. Vik-anrikningar av 4 olika gener (MEF2, slöfock, prospero, soxNeuro) beräknades jämfört med ingången och normaliseras mot RpL32 genen (Figur 1D). Dessa resultat visade 2,3-faldig anrikning av pan-muskel gen MEF2 och 5,6-faldig anrikning av slöfock genen. Däremot har de två generna uttrycks i nervsystemet utarmat jämfört med ingången. Mycket liknande gånger avvikelsevärden observerades på 3 biologiska replikat, visar att protokollet är robust. Med Slouch-Gal4 förare och börja med 1,5 g, runt erhölls 1,5x10 ^ 6 embryon som innehåller 100 GFP celler / embryo (totalt 150 × 10 ^ 6 positivceller). Efter att ha kört TRAP experiment, är avkastningen cirka 25-45 ng av specifik RNA beroende på scenen av intresse. Detta material är tillräckligt för att driva microarray analys eller RNA-punkter med användning av en förstärkningsprotokoll bygga en RNA-punkter bibliotek. Effektivitet beror starkt på styrkan av drivrutin som används för att uttrycka RpL10A-EGFP. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figur 1. Kvalitet och specificitet bedömning av TRAP-isolerade RNA från Slouch-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP embryon. (AB) Confocal bilder av en scen-16 embryo visar RpL10A-EGFP expression specifikt i de sex Slouch muskelceller per hemisegment (A). Samlokalisering av RpL10A-EGFP med den allmänna muskelmarkör Beta3tubulin observeras på sammanslagnings bild (B). (C) Kvalitetskontroll av Traped RNA ran på Bioanalyzer visar perfekt integritet rRNA 18S och 28S. (D) RT-qPCR analys som visar hög specificitet av TRAP-isolerade mRNA experiment på 3 biologiska replikat av scen 16 embryon. Faldig förändring beräknas jämfört med ingången och normaliseras mot RpL32 genen. MEF2 avskrifter närvarande i alla muskel linjer är 2,3 gånger berikad jämfört med ingången medan mer begränsade slöfock transkript är 5,6 gånger berikad. Neurala celler som uttrycker prospero och soxN gener utarmade 2,2-faldigt och 5,5-faldigt respektive. Felstaplar representerar standardavvikelse (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Översättning Ribosom Affinity Purification från sällsynta cellpopulationer av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In vivo Centrifugering av Drosophila embryon

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upprätt Imaging av Drosophila Embryon

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primära cellkulturer från Drosophila Gastrula Embryon

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifiering av Protein Samverkande Partners Använda Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Hög genomströmning Rening av Affinity-märkta rekombinanta proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Rening av Transkript och metaboliter från<em&gt; Drosophila</em&gt; Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...