Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر غلين سلوكم (كلية الطب في ويسكونسن) وكولين A. لافين (الصكوك نيكون المؤتمر الوطني العراقي) للحصول على المساعدة الفنية ممتازة مع التجارب المجهري. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL108880 (لAS)، R01 DK095029 (لOPO) وK99 HL116603 (لTSP)، المؤسسة الوطنية للكلى IG1724 (لTSP)، وجمعية القلب الأميركية 13GRNT16220002 (لOPO) و وJ. زمالة بن Lipps البحوث من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى (لDVI).

وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان في كلية الطب في ويسكونسن وجامعة تكساس مركز العلوم الصحية في هيوستن وكان وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. الشكل 1 يوضح ا?...

وصفنا هنا تطبيقات التقليدية تقنية التصحيح، المشبك والتصوير epifluorescence الكالسيوم إلى الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المستمدة من نموذج الجيني الفئران من ARPKD. يتكون البروتوكول من ثلاث خطوات، والتي ينبغي أن تدفع معظم الاهتمام إلى عزل الخراجات (الخطوة 1.5 من قسم البروتوكو...

القنوات الأيونية تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. مقهورة أمراض الكلى المتعدد الكيسات السائدة والمتنحية (ADPKD وARPKD، على التوالي) هي اضطرابات وراثية تتميز تطوير مملوءة بسائل الكيسات الكلوية من أصل الخلايا الظهارية أنبوبي. ويتسبب ADPKD بواسطة طفرات من PKD1 أو PKD2 الجينات التي تكود polycystins 1 و 2، والبروتينات غشاء تشارك في تنظيم تكاثر الخلايا والتمايز. PKD2 في حد ذاته أو مجمع مع PKD1 تعمل أيضا بمثابة الكالسيوم 2+ الموجبة -permeable قناة 1. الطفرات من PKHD1 ترميز الجين fibrocystin (أ-مثل مستقبلات البروتين المرتبط أهداب المشاركة في tubulogenesis و / أو صيانة قطبية ظهارة) هي دفعة الجيني للARPKD 2. هو ظاهرة معقدة رافقت نمو الكيس مع انتشار اضطراب 3،4، 5 الأوعية الدموية، فقد التمايز وفقدان القطبيةإيتي الخلايا الأنبوبية 6-8. عيب استيعاب وإفراز المعزز في ظهارة الكيسي يسهم في تراكم السوائل في التجويف والكيس التوسع 9،10. ضعف تعتمد على تدفق [كا 2+] وقد تم ربط ط يشير أيضا إلى تكون الكيسة خلال PKD 11-15. هنا، نحن تصف طريقة مناسبة لقياس التصحيح، المشبك النشاط قناة واحدة والخلايا مستويات الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المعزولة من الفئران PCK. تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح من قبلنا لوصف النشاط من قناة الظهارية نا + (عناق) 10 و [كا 2+] أنا معتمد على العمليات الناجمة عن الكالسيوم 2+ TRPV4 -permeable وpurinergic يشير شلال 13. في هذه الدراسات استخدمنا الفئران PCK، وهذا نموذج من ARPKD الناجمة عن طفرة تلقائية في الجين PKHD1. كان من سلالة PCK اصلاذ المستمدة من سبراج داولي (SD) الفئران تستخدم 16 الجرذان وبالتالي التنمية المستدامة باعتبارها الرقابة المناسبة للمقارنة بسلالة PCK. ونتيجة لذلك، يمكن على حد سواء SD الفئران شرائح كليون والقنوات غير المتوسعة جمع المعزولة من الفئران PCK نفس بمثابة مجموعتين مقارنة مختلفة لتجارب على ظهارة الكيسي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

بدء الكيس والتوسع خلال مرض الكلى المتعدد الكيسات هي عملية معقدة تتميز شذوذ في تكاثر الخلايا أنبوبي، وتراكم السوائل اللمعية وتشكيل مصفوفة خارج الخلية. آخر من القنوات الأيونية وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا والمعلمات الفسيولوجية الرئيسية التي تحدد مهام خلايا الطلائية. طورنا طريقة مناسبة لمراقبة الوقت الحقيقي من النشاط القنوات الأيونية مع تقنية التصحيح، المشبك وتسجيل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية المعزولة حديثا من الكيسات الكلوية. الفئران PCK، وهذا نموذج الجيني للراثي مقهور مرض الكلى المتعدد الكيسات (ARPKD)، استخدمت هنا لخارج الحي تحليل القنوات الأيونية وتدفق الكالسيوم. وصف هنا هو إجراء مفصلة خطوة بخطوة تهدف إلى عزل الطبقات الوحيدة الكيسي والأنابيب غير متسعة من PCK أو العادية سبراغ داولي (SD) الفئران، ومراقبة نشاط قناة واحدة والكالسيوم داخل الخلايا 2+ ديناميات.هذه الطريقة لا تتطلب المعالجة الأنزيمية ويسمح تحليل في وضع الأصلي للالمعزولة حديثا أحادي الطبقة الظهارية. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية حساسة جدا للتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. وأخيرا، ظهارة الكيسي المعزولة يمكن أيضا استخدامها لتلطيخ مع الأجسام المضادة أو الأصباغ، وإعداد الثقافات الأولية وتنقية لمختلف فحوصات البيوكيميائية.

وقد ثبت تورط محتمل في عناق تكون الكيسة من قبل العديد من الدراسات أن لوحظ تعطل عامل نمو البشرة (EGF) يشير في PKD تقدم 22-25 وغير طبيعي استيعاب الصوديوم في ARPKD نماذج الفئران والثقافات الأنسجة 26-28. على سبيل المثال، Veizis وآخرون أظهرت أن تراعي الأميلوريد نا +...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

القنوات الأيونية التي أعرب عنها في ظهارة أنبوبي كلوي تلعب دورا هاما في علم الأمراض من مرض الكلى المتعدد الكيسات. نحن هنا وصف البروتوكولات التجريبية استخدامها لإجراء التحليل ومستوى الكالسيوم داخل الخلايا القياسات التصحيح، المشبك في ظهارة الكيسي المعزولة حديثا من الكلى القوارض.

تنفيذ المشبك التصحيح وايف مضان المجهر لرصد خصائص الوظيفية للالمعزولة حديثا PKD الظهارة

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

الضغط تلميع الماصات لتسجيل باتش تحسين المشبك

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

على قناة واحدة وتحليل الكالسيوم التصوير في Podocytes من الكبيبات المعزولة حديثا

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...