Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidies R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (naar OPO) en K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (naar OPO) en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).

De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het Medical College of Wisconsin en de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van de isolatie weefsel en veredeling. In het kort worden de nieren van PCK of SD-ratten gebruikt voor het handmatig isoleren van epitheli...

We hier beschreven toepassingen van conventionele patch-clamp techniek en epifluorescentie calcium beeldvorming om cystic epitheelmonolagen afgeleid van een muizen genetisch model van ARPKD. Het protocol bestaat uit drie stappen, waarbij de meeste aandacht moet worden besteed aan de isolatie van de cysten (stap 1.5 van de sectie protocollen) en de elektrofysiologische studies. Deze belangrijke procedures vereisen uitgebreide training en geduld, en de lezer mag niet worden gefrustreerd tegelijk. <p class="jove_conten...

Ionenkanalen spelen een belangrijke rol in vele fysiologische functies, waaronder celgroei en differentiatie. Autosomaal dominante en recessieve polycystische nierziekten (ADPKD en ARPKD respectievelijk) genetische aandoeningen gekenmerkt door de ontwikkeling van renale vloeistof gevulde cysten van de buisvormige epitheelcel oorsprong. ADPKD wordt veroorzaakt door mutaties van PKD1 of PKD2 genen die polycystins 1 en 2, membraaneiwitten betrokken bij de regulering van celproliferatie en differentiatie. PKD2 op zichzelf of als een complex met PKD1 ook functioneren als een Ca2 + -doorlaatbare kationenkanaal 1. Mutaties van het gen dat codeert fibrocystin PKHD1 (a cilia-geassocieerde receptor-achtige eiwitten die betrokken zijn bij de tubulogenesis en / of onderhoud van polariteit van epitheel) de genetische impuls van ARPKD 2. Cyste groei is een complex fenomeen gepaard met verstoorde proliferatie 3,4, angiogenese 5, dedifferentiatie en het verlies van polaireteit van de tubulaire cellen 6-8. Defecte reabsorptie en augmented secretie in cystic epitheel bijdragen aan vochtophoping in het lumen en cyste uitbreiding 9,10. Verminderde doorstroming afhankelijk [Ca 2+] i signalering is ook gekoppeld aan cystogenesis tijdens PKD 11-15. Hier beschrijven we een werkwijze geschikt voor patch-clamp metingen van één kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + niveaus in cystic epitheliale monolagen geïsoleerd van PCK ratten. Deze methode werd met succes toegepast door ons te karakteriseren van activiteit van de epitheliale Na + kanaal (ENaC) 10 en [Ca 2+] i afhankelijke processen veroorzaakt door Ca 2+ -doorlaatbare TRPV4 en purinerge signalisatie cascade 13. In deze studies gebruikten we PCK ratten, een model van ARPKD veroorzaakt door een spontane mutatie in het gen PKHD1. De PCK stam was originally afkomstig van Sprague-Dawley (SD) ratten 16 daardoor SD ratten gekozen als controle voor vergelijking met de PCK stam. Daardoor kan zowel SD rat nefron segmenten en niet-verwijde verzamelbuizen geïsoleerd uit dezelfde PCK ratten dienen als twee vergelijkingsgroepen voor experimenten op cystic epitheel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Cyste initiatie en uitzetting gedurende polycystische nierziekte is een complex proces gekenmerkt door afwijkingen in buisvormige celproliferatie, luminale vochtophoping en extracellulaire matrixvorming. Activiteit van ionkanalen en intracellulaire calcium signalering zijn belangrijke fysiologische parameters welke functies van tubulaire epitheel te bepalen. We ontwikkelden een methode geschikt is voor real-time observatie van ionkanalen activiteit met patch-clamp techniek en de registratie van de intracellulaire Ca 2+ niveau epitheelmonolagen vers geïsoleerd van renale cysten. PCK ratten, een genetisch model van autosomaal recessieve polycystische nierziekte (ARPKD), hier werden gebruikt voor de ex vivo analyse van ionkanalen en calcium flux. Hier beschreven is een gedetailleerde stap-voor-stap procedure die tot cystic monolagen en de niet verwijde buisjes van PCK of normaal Sprague Dawley (SD) ratten isoleren en controleren enkel kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + dynamiek.Deze methode niet enzymatische verwerking vereisen en maakt analyse in een inheemse setting van vers geïsoleerde epitheliale monolaag. Bovendien is deze techniek zeer gevoelig is voor intracellulaire calcium veranderingen genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen. Tenslotte kunnen geïsoleerde blaas epitheel verder worden gebruikt voor kleuring met antilichamen of kleurstoffen, bereiden van primaire kweken en zuivering van verschillende biochemische assays.

Potentiële ENaC betrokkenheid bij cystogenesis is aangetoond door verscheidene studies die verstoorde epidermale groeifactor (EGF) waargenomen signalering in PKD progressie 22-25 en abnormale natrium reabsorptie in ARPKD muizenmodellen en weefselculturen 26-28. Zo Veizis et al. Toonde aan dat de amiloride gevoelige Na + absorptie verminderd bij CD cellen van de niet-orthologe BPK muismodel van ARPKD 29. We hebben onlangs aangetoond dat een verminderde natrium en wate...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Methoden voor Patch Clamp capaciteit Recordings uit de Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Druk polijsten pipetten voor verbeterde patch-clamp opnemen

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Giant liposoombereiding for Imaging en patch-clamp elektrofysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...