Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopieexperimente bedanken. Diese Studie wurde von der National Institutes of Health gewährt R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (nach OPO) und K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (nach OPO) und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).

Die nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee am Medical College of Wisconsin und der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Figur 1 zeigt wesentliche Schritte des Gewebes Isolierung und Verarbeitungsverfahren. Kurz gesagt, werden Nieren von PCK oder SD-Ratten für die manuelle Isolier...

Wir hier beschriebenen Anwendungen von herkömmlichen Patch-Clamp-Technik und Epifluoreszenz Calcium Imaging, um zystische Epithelzellen-Monoschichten aus einem Maus-Modell der genetischen ARPKD abgeleitet. Das Protokoll besteht aus drei Schritten, von denen die meisten Aufmerksamkeit ist auf die Isolierung der Zysten (Schritt 1.5 der Protokolle Abschnitt) und an die elektrophysiologische Studien bezahlt werden. Diese Schlüssel Verfahren erfordern umfangreiche Schulungen und Geduld, und der Leser sollte nicht enttäusc...

Ionenkanäle spielen eine wichtige Rolle bei vielen physiologischen Funktionen, einschließlich Zellwachstum und Differenzierung. Autosomal dominante und rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD und ARPKD bezeichnet) sind genetische Störungen, die durch die Entwicklung von Nierenflüssigkeitsgefüllten Zysten des Rohr Epithelzelltumoren. ADPKD Mutationen von PKD1 oder PKD2 Gene Polyzystinen 1 und 2, Membranproteine ​​in der Regulation der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt kodiert verursacht. PKD2 allein oder als Komplex mit PKD1 fungieren auch als Ca 2+ durchlässige Kationenkanals 1. Mutationen des PKHD1 kodierende Gen Fibrocystin (a Zilien-assoziierten Rezeptor-ähnlichen Proteins in der Tubulogenese und / oder Wartung Polarität Epithel beteiligt sind) sind die genetischen Anstoß ARPKD 2. Zystenwachstum ist ein komplexes Phänomen mit gestörter Proliferation 3,4, Angiogenese 5, Dedifferenzierung und Verlust der polaren begleitetkeit von röhrenförmigen Zellen 6-8. Defekten Reabsorption und Sekretion in Augmented Zystenepithel tragen zu einer Flüssigkeitsansammlung in dem Lumen und Zystenexpansions 9,10. Impaired strömungsabhängige [Ca 2+] i-Signalisierung wurde auch cystogenesis während PKD 11-15 verbunden. Hier beschreiben wir eine für Patch-Clamp-Messungen von Einzelkanal-Aktivität und der intrazellulären Ca 2+ -Spiegel bei zystischer epithelialen Monoschichten von PCK Ratten isoliert Methode. Dieses Verfahren wurde von uns erfolgreich angewendet, um der Aktivität des epithelialen Na + -Kanal (ENaC) 10 charakterisieren und [Ca 2+] i -abhängigen Prozesse durch Ca 2+ durchlässige TRPV4 und purinergen Signalkaskade 13 induziert. In diesen Studien verwendeten wir PCK Ratten ein Modell ARPKD durch eine spontane Mutation in dem PKHD1 Gen verursacht. Die PCK-Stamm war originally von Sprague-Dawley (SD) Ratten 16 dadurch SD-Ratten werden als eine geeignete Kontrolle zum Vergleich mit dem PCK verwendete Stamm abgeleitet ist. Als Ergebnis können beide SD-Ratte nephron Segmenten und nicht-erweiterten Sammelkanäle vom selben PCK Ratten isoliert, wie zwei unterschiedliche Vergleichsgruppen für Versuche zur Zystenepithel dienen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Zysten Initiierung und Ausdehnung während polyzystische Nierenerkrankung ist ein komplexer Prozess, gekennzeichnet durch Abnormalitäten in Rohrzellproliferation, luminale Flüssigkeitsansammlung und die extrazelluläre Matrixbildung. Aktivität von Ionenkanälen und der intrazellulären Calcium-Signalgebung sind wichtige physiologische Parameter die Funktionen der Tubulusepithel bestimmen. Wir entwickelten ein für Echtzeit-Beobachtung von Ionenkanälen Aktivität mit Patch-Clamp-Technik, und die Registrierung der intrazellulären Ca 2+ Pegel in epithelialen Mono frisch aus Nierenzysten isoliert Methode. PCK-Ratten, ein genetisches Modell der autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD), wurden für die ex vivo Analyse der Ionenkanäle und Calciumfluss verwendet. Beschrieben wird hier eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren entwickelt, um zystische Monoschichten und nicht-dilatierten Tubuli von PCK oder normaler Sprague Dawley (SD) Ratten, zu isolieren und zu überwachen Einzelkanalaktivität und intrazelluläre Ca 2+ Dynamik.Dieses Verfahren erfordert keine enzymatische Verarbeitung und ermöglicht die Analyse in einer nativen Einstellung der frisch isolierten Epithelzellen-Monoschicht. Darüber hinaus ist diese Technik sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calciumänderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen. Schließlich kann isoliert Zystenepithel weiter zum Anfärben mit Antikörpern oder Farbstoffe, wurden primäre Kulturen und Reinigung für verschiedene biochemische Assays verwendet werden.

Potential ENaC Beteiligung cystogenesis durch mehrere Studien, die gestört epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) beobachtet Signalisierung in PKD Progression 22-25 und abnorme Natriumreabsorption in ARPKD Mausmodellen und Gewebekulturen 26-28 nachgewiesen. B. Veizis et al. Zeigten, dass Amilorid-sensitive Na + -Absorption in CD-Zellen aus dem nicht-ortho BPK Mausmodell ARPKD 29 verringert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass beeinträchtigte Natrium und Wasser Rückresorpt...

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Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Ionenkanäle in renale tubuläre Epithel ausgedrückt spielen eine bedeutende Rolle in der Pathologie der polyzystischen Nierenerkrankung. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle verwendet, um Patch-Clamp-Analyse und intrazellulären Calcium-Pegelmessungen in Zystenepithel frisch aus Nagetier Nieren getrennt durchzuführen.

Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...