Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
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लेखकों माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के साथ उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ग्लेन Slocum (विस्कॉन्सिन के मेडिकल कॉलेज) और कोलीन ए Lavin (Nikon उपकरण इंक) को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस अध्ययन (एएस) के लिए R01 HL108880, (OPO करने के लिए) R01 DK095029 और (टीएसपी) के लिए K99 HL116603, (टीएसपी) के लिए नेशनल किडनी फाउंडेशन IG1724, (OPO करने के लिए) अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 13GRNT16220002 और अनुदान के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया (डीवीआई करने के लिए) नेफ्रोलोजी के अमेरिकन सोसायटी की ओर से बेन जे Lipps रिसर्च फैलोशिप।

नीचे वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं विस्कॉन्सिन और ह्यूस्टन में टेक्सास के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय के मेडिकल कॉलेज में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है औ?...

हम ARPKD की एक murine आनुवंशिक मॉडल से प्राप्त सिस्टिक उपकला monolayers के लिए यहां पारंपरिक पैच दबाना तकनीक और epifluorescence कैल्शियम इमेजिंग के आवेदनों का वर्णन किया। प्रोटोकॉल सबसे ज्यादा ध्यान अल्सर (प्रोटोकॉल खंड के ?...

आयन चैनल सेल के विकास और भेदभाव सहित कई शारीरिक कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। Autosomal प्रमुख और पीछे हटने का पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोगों (क्रमशः ADPKD और ARPKD,) ट्यूबलर उपकला कोशिका मूल के गुर्दे तरल पदार्थ से भरे अल्सर के विकास के द्वारा होती आनुवंशिक विकार हैं। ADPKD polycystins 1 और सेल प्रसार और भेदभाव के नियमन में शामिल 2, झिल्ली प्रोटीन एन्कोडिंग PKD1 या PKD2 जीन के म्यूटेशन के कारण होता है। स्वयं के द्वारा या PKD1 के साथ एक जटिल रूप PKD2 भी एक सीए 2 पारगम्य कटियन चैनल 1 के रूप में कार्य करते हैं। PKHD1 जीन एन्कोडिंग fibrocystin (tubulogenesis और / या उपकला के polarity के रखरखाव में शामिल एक सिलिया जुड़े रिसेप्टर की तरह प्रोटीन) के उत्परिवर्तन ARPKD 2 की आनुवंशिक प्रोत्साहन कर रहे हैं। पुटी विकास एक जटिल घटना से परेशान प्रसार 3,4, angiogenesis को 5, dedifferentiation और ध्रुवीय की हानि के साथ साथ हैट्यूबलर कोशिकाओं 6-8 की अल्पसंख्यक। सिस्टिक उपकला में दोषपूर्ण पुनःअवशोषण और संवर्धित स्राव लुमेन और पुटी विस्तार 9,10 में तरल पदार्थ जमा करने के लिए योगदान करते हैं। बिगड़ा प्रवाह पर निर्भर [सीए 2 +] मैं सिगनल भी PKD 11-15 दौरान cystogenesis से जोड़ा गया है। यहाँ, हम एक चैनल गतिविधि और PCK चूहों से अलग सिस्टिक उपकला monolayers में इंट्रासेल्युलर सीए 2 स्तरों के पैच दबाना माप के लिए उपयुक्त विधि का वर्णन है। इस पद्धति को सफलतापूर्वक उपकला ना + चैनल (ENaC) 10 की गतिविधि के लिए चिह्नित करने के लिए हमारे द्वारा लागू किया गया था और [सीए 2 +] मैं सीए 2 पारगम्य TRPV4 और purinergic संकेत झरना 13 से प्रेरित प्रक्रियाओं निर्भर। इन अध्ययनों में हम PCK चूहों, PKHD1 जीन में एक सहज उत्परिवर्तन के कारण होता ARPKD के एक मॉडल का इस्तेमाल किया। PCK तनाव originall थाSprague-Dawley (एसडी) चूहों 16 जिससे एसडी चूहों PCK तनाव के साथ तुलना के लिए एक उचित नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं से निकाली गई वाई। नतीजतन, एक ही PCK चूहों से अलग एसडी चूहे नेफ्रॉन क्षेत्रों और गैर फैली हुई संग्रह नलिकाओं दोनों सिस्टिक उपकला पर प्रयोगों के लिए दो अलग अलग तुलना समूहों के रूप में सेवा कर सकते हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के दौरान पुटी दीक्षा और विस्तार ट्यूबलर सेल प्रसार, ल्यूमिनल तरल पदार्थ जमा और बाह्य मैट्रिक्स गठन में असामान्यताओं की विशेषता एक जटिल प्रक्रिया है। आयन चैनल और intracellular कैल्शियम सिगनल की गतिविधि ट्यूबलर उपकला के कार्यों को निर्धारित जो महत्वपूर्ण शारीरिक मापदंडों हैं। हम हौसले गुर्दे अल्सर से अलग उपकला monolayers में इंट्रासेल्युलर सीए 2 स्तर का पैच दबाना तकनीक और पंजीकरण के साथ आयन चैनल गतिविधि का वास्तविक समय अवलोकन के लिए उपयुक्त एक विधि विकसित की है। PCK चूहों, ऑटोसोमल रिसेसिव पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (ARPKD) के एक आनुवंशिक मॉडल, आयन चैनलों और कैल्शियम प्रवाह के पूर्व vivo विश्लेषण के लिए यहां इस्तेमाल किया गया। यहाँ वर्णित एक चैनल गतिविधि और intracellular सीए 2 गतिशीलता सिस्टिक monolayers और PCK या सामान्य Sprague Dawley (एसडी) चूहों से गैर फैली हुई नलिकाओं को अलग, और निगरानी करने के लिए बनाया गया एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रक्रिया है।इस विधि एंजाइमी संसाधन की आवश्यकता होती है और हौसले से अलग उपकला monolayer के एक देशी सेटिंग में विश्लेषण की अनुमति देता नहीं है। इसके अलावा, इस तकनीक intracellular कैल्शियम परिवर्तन करने के लिए बहुत संवेदनशील है और सटीक मापन के लिए उच्च संकल्प छवियों उत्पन्न करता है। अंत में, अलग-थलग सिस्टिक उपकला आगे एंटीबॉडी या रंजक, विभिन्न जैव रासायनिक assays के लिए प्राथमिक संस्कृतियों की तैयारी और शुद्धि के साथ धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Cystogenesis में संभावित ENaC भागीदारी ARPKD murine मॉडल और ऊतक संस्कृतियों 26-28 में PKD प्रगति 22-25 और असामान्य सोडियम पुनःअवशोषण में संकेत बाधित epidermal वृद्धि कारक (EGF) मनाया कि कई अध्ययनों से प्रदर्शित किया गया है। उदा?...

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Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

गुर्दे ट्यूबलर उपकला में व्यक्त आयन चैनल पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग की विकृति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहाँ हम हौसले कृंतक गुर्दे से अलग सिस्टिक उपकला में पैच दबाना विश्लेषण और intracellular कैल्शियम के स्तर का मापन का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

पैच दबाना और लाइव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को लागू हौसले से पृथक PKD उपकला के कार्यात्मक संपत्तियों को मॉनिटर करने के लिए

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Calyx से पैच दबाना समाई रिकॉर्डिंग के लिए तरीके

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Xenopus oocytes में व्यक्त आयन चैनल के पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

बेहतर पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए दबाव चमकाने pipettes

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

स्टोर संचालित जीवित कोशिकाओं में कैल्शियम प्रविष्टि प्रतिदीप्ति आधारित मापन संवर्धित सेल कैंसर से कंकाल की मांसपेशी फाइबर

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

विखंडन खमीर के मात्रात्मक लाइव सेल विश्लेषण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

इमेजिंग और पैच दबाना इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए विशालकाय Liposome तैयारी

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

एक चैनल सेल संलग्न पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

एक transmembrane प्रोटीन के पुनर्गठन, माइक्रोस्कोपी और पैच दबाना अध्ययन के लिए विशालकाय unilamellar vesicles में वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

हौसले से अलग glomeruli की Podocytes में एकल चैनल विश्लेषण और कैल्शियम इमेजिंग

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...