Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
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著者は、顕微鏡実験で優れた技術支援のためにグレン・スローカム（ウィスコンシン医科大学）とコリーンA.ラビン（ニコンインスツルメンツ社）を感謝したいと思います。この研究は、（OPO）はアメリカ心臓協会13GRNT16220002、（TSP）に国立衛生研究所（TSPに）R01 HL108880（AS）は、（OPO）にR01 DK095029とK99 HL116603を付与し、国立腎臓財団IG1724によってサポートされていましたし、 （DVI）に米国腎臓学会からベン・J・リップス研究フェローシップ。

以下に記載の実験手順は、ウィスコンシン医科大学で機関動物実験委員会によって承認され、ヒューストンでのテキサス大学健康科学センター、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従ってありました。 図1は、組織の単離および処理手順の主要ステップを示しています。簡単に言うと、PCKまたはSDラットからの腎臓は健康な非ダイヤルした細管または嚢胞の?...

私たちは、ARPKDのマウス遺伝モデル由来嚢胞上皮単層に、ここで、従来のパッチクランプ法と落射蛍光カルシウムイメージングのアプリケーションを記述しました。プロトコルは、最も注意が嚢胞（プロトコルセクションのステップ1.5）の単離および電気生理学的研究に支払われるべき3つのステップで構成されています。これらのキーの手順では、広範囲の訓練と忍耐を必要とし、読者は一?...

イオンチャネルは、細胞の増殖および分化を含む多くの生理学的機能に重要な役割を果たしています。常染色体優性と劣性嚢胞腎疾患（ADPKDおよびARPKD、それぞれ）尿細管上皮細胞由来の腎臓の液体で満たされた嚢胞の開発によって特徴付けられる遺伝性疾患です。 ADPKDはpolycystins 1及び細胞増殖および分化の調節に関与する2は、膜タンパク質をコードするPKD1またはPKD2遺伝子の突然変異によって引き起こされます。それ自体で、またはPKD1との複合体としてPKD2もの Ca 2+ -permeable陽イオンチャネル1として機能します。 PKHD1をコードする遺伝子fibrocystin（細管形成および/ ​​または上皮の極性の維持に関与する繊毛関連受容体様タンパク質）の変異は、ARPKD 2の遺伝子原動力です。嚢胞の成長が乱れた増殖3,4、血管新生5、脱分化および極性の喪失を伴う複雑な現象であります尿細管細胞6-8の性。 嚢胞上皮の欠陥再吸収と増強分泌は、内腔と嚢胞拡大9,10内の流体の蓄積に貢献しています。障害フロー依存の[Ca 2+] iのシグナリングがまた、PKD 11-15の間に嚢胞形成にリンクされています。 ここでは、単一チャネル活性とPCKラットから分離された嚢胞性上皮単層における細胞内Ca 2+レベルのパッチクランプ測定のための適切な方法を説明します。このメソッドは、正常上皮 Na +チャネル（ENaC）10の活性を特徴づけるために私達によって適用し、[Ca 2+] iのの Ca 2+ -permeable TRPV4とプリンシグナリングカスケード13によって誘導されたプロセスを依存しました。 これらの研究では、PCKラット、PKHD1遺伝子における自然突然変異によって引き起こさARPKDのモデルを使用しました。 PCK株はoriginallましたスプラーグ-ドーリー（SD）ラットに由来するY 16それによってSDラットをPCK株と比較するための適切なコントロールとして使用されています。その結果、同じPCKラットから単離されたSDラットのネフロンセグメントと非拡張集合管の両方が、嚢胞上皮での実験のための2つの異なる比較群として機能することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

多発性嚢胞腎嚢胞中の開始と拡大は尿細管細胞増殖の異常、管腔流体の蓄積および細胞外マトリックス形成を特徴とする複雑なプロセスです。イオンチャネルおよび細胞内カルシウムシグナル伝達の活性は、尿細管上皮の機能を決定する重要な生理学的パラメータです。我々は、新たに腎嚢胞から単離された上皮単層における細胞内Ca 2+レベルのパッチクランプ法と登録のイオンチャネル活性のリアルタイム観察に適した方法を開発しました。 PCKラット、常染色体劣性多発性嚢胞腎（ARPKD）の遺伝的モデルは、イオンチャネルおよびカルシウムフラックスの ex vivo分析のためにここで使用しました。ここで説明するには、PCKまたは通常のスプラーグドーリー（SD）ラットから嚢胞性単層と非拡張型細管を分離し、単一チャネル活性および細胞内Ca 2+動態を監視するために設計された、詳細なステップバイステップの手順です。この方法は、酵素処理を必要とし、新たに単離した上皮単層の本来の設定で分析を可能にしません。また、この技術は、細胞内カルシウムの変化に非常に敏感であり、正確な測定のために、高解像度の画像を生成します。最後に、単離された嚢胞上皮はさらに、抗体または染料を用いて、様々な生化学的アッセイのための一次培養および精製の調製物を染色するために使用することができます。

嚢胞形成の潜在的な関与のENaCは、PKDの進行22-25とARPKDマウスモデルおよび組織培養26-28における異常なナトリウム再吸収シグナリング破壊上皮成長因子（EGF）を観察し、いくつかの研究によって実証されています。例えば、Veizis らアミロライド感受性のNa +吸収をARPKD 29の非オルソロガスBPKマウスモデルからCD細胞において減少することを示しました。我?...

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Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

尿細管上皮細胞で発現するイオンチャネルは、多発性嚢胞腎疾患の病理において重要な役割を果たす。ここでは、新たにげっ歯類の腎臓から単離された胆嚢上皮におけるパッチクランプ分析を行うために使用される実験プロトコルおよび細胞内カルシウムレベルの測定を説明します。

新たに単離したPKD上皮の機能的特性を監視するためにパッチクランプし、ライブ蛍光顕微鏡を実装

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

Biology

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一チャネルセル付パッチクランプ法

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新たに単離した糸球体の足細胞における単一チャネル分析とカルシウムイメージング

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