Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) og Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) for utmerket teknisk assistanse med mikroskopi eksperimenter. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health gir R01 HL108880 (til AS), R01 DK095029 (til OPO) og K99 HL116603 (til TSP), National Kidney Foundation IG1724 (til TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (til OPO) og Ben J. Lipps Stipendiat fra American Society of Nefrologi (til DVI).

De eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Medical College of Wisconsin og University of Texas Health Science Center på Houston og var i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Figur 1 viser hovedtrinnene i vev isolasjon og prosesseringsprosedyre. Kort fortalt er nyrer fra PCK eller SD-rotter brukes til manuell isolering av epitelmonolag for innsamling kanaler enten fra friske ikke-slå...

Vi beskrev her anvendelser av konvensjonell patch-clamp teknikken og epifluorescence kalsium bildebehandling til cystisk epitelmonolag avledet fra en murine genetisk modell av ARPKD. Protokollen består av tre trinn, hvorav den mest oppmerksomhet bør rettes mot isolering av cyster (trinn 1.5 av protokoller delen) og til de elektrofysiologiske studier. Disse nøkkel prosedyrer krever omfattende opplæring og tålmodighet, og leseren bør ikke være frustrert på en gang. Først av alt, bør ...

Ionekanaler spille en betydelig rolle i mange fysiologiske funksjoner, inkludert cellevekst og differensiering. Autosomal dominant og recessive Polycystisk nyre sykdommer (ADPKD og ARPKD, henholdsvis) er genetiske lidelser preget av utviklingen av nyrevæskefylte cyster av røret epitelcelle opprinnelse. ADPKD er forårsaket av mutasjoner av PKD1 eller PKD2 gener som koder polycystins 1 og 2, membranproteiner som er involvert i regulering av celleproliferasjon og differensiering. PKD2 av seg selv eller som et kompleks med PKD1 også fungere som en Ca2 + -permeable kation kanal en. Mutasjoner i genet som koder for fibrocystin PKHD1 (a cilia-assosiert reseptor-lignende protein som er involvert i tubulogenesis og / eller vedlikehold av polariteten til epitel) er genetisk drivkraften i ARPKD 2. Cyste veksten er et komplekst fenomen akkompagnert med forstyrret spredning 3,4, angiogenese 5, dedifferentiation og tap av polarligheten av rørformede celler 6-8. Defekt reabsorpsjon og utvidet sekresjon ved cystisk epitel bidra til væskeansamling i lumen og cyste utvidelse 9,10. Nedsatt strømningsavhengige [Ca2 +] signalering er også knyttet til cystogenesis under PKD 11-15. Her beskriver vi en fremgangsmåte egnet for patch-clamp målinger av enkeltkanalaktivitet og intracellulære Ca 2 + nivåer i pasienter med cystisk epitelmonolag isolert fra PCK rotter. Denne metoden ble anvendt med hell ved oss å karakterisere aktiviteten av epiteliale Na + kanal (ENaC) 10 og [Ca2 +] -avhengige prosesser som induseres av Ca 2 + -permeable TRPV4 og purinergiske signalkaskade 13. I disse studiene har vi brukt PCK rotter, en modell av ARPKD forårsaket av en spontan mutasjon i PKHD1 genet. Den PCK stammen var originally avledet fra Sprague-Dawley (SD) rotter som 16 derved SD-rotter blir anvendt som en egnet kontroll for sammenligning med PCK belastning. Som et resultat kan både SD rotte nevronet segmenter og ikke-utvidede oppsamlingskanaler isolert fra samme PCK rotter tjener som to forskjellige sammenligningsgrupper for eksperimenter med cystisk epitel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Cyste initiering og ekspansjon i løpet av polycystisk nyresykdom er en kompleks prosess som kjennetegnes ved unormaliteter i rørformet celleproliferasjon, luminal væskeopphopning og ekstracellulær matrisedannelse. Aktivitet av ionekanaler og intracellulær kalsium signalisering er sentrale fysiologiske parametere som bestemmer funksjonene rørformet epitel. Vi utviklet en metode som passer for sanntids observasjon av ionekanaler aktivitet med patch-clamp teknikken og registrering av intracellulær Ca 2+ nivå i epitelmonolag nyisolerte fra nyrecyster. PCK rotter, en genetisk modell av autosomal recessiv polycystisk nyresykdom (ARPKD), ble brukt her for ex vivo analyse av ionekanaler og kalsium flux. Beskrevet her er en detaljert trinn-for-trinn fremgangsmåte er utformet for å isolere cystisk monolagene og ikke-utvidede rørelementer fra PCK eller normale Sprague Dawley (SD) rotter, og overvåke enkeltkanalaktivitet og intracellulære Ca 2 + dynamikk.Denne metoden krever ikke enzymatisk behandling og lar analyse i en innfødt innstilling av nystekte isolert epitel enkeltlag. Dessuten er denne teknikk meget følsom for endringer i den intracellulære kalsium og genererer bilder med høy oppløsning for nøyaktige målinger. Endelig kan isoleres cystisk epitel videre brukes for farging med antistoffer eller fargestoffer, fremstillingen av primærkulturer og rensing av forskjellige biokjemiske analyser.

Potensialet ENaC engasjement i cystogenesis har blitt demonstrert av flere studier som observerte forstyrret epidermal vekstfaktor (EGF) signale i PKD progresjon 22-25 og unormal natrium reabsorpsjon i ARPKD murine modeller og vevkulturer 26-28. For eksempel, Veizis et al., Viste at amilorid-sensitive Na + absorpsjon er nedsatt i CD-celler fra ikke-ortologe BPK musemodell for ARPKD 29. Vi har nylig vist at nedsatt natrium og vann reabsorpsjon i cyster er en viktig fak...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Ionekanaler uttrykt i nyretubuli epitel spille en betydelig rolle i patologi polycystisk nyresykdom. Her beskriver vi eksperimentelle protokollene som brukes til å utføre patch-clamp analyse og intracellulær kalsium nivå målinger ved cystisk epitel fersk isolert fra gnager nyrer.

Implementering Patch Clamp og Live Fluorescensmikroskopi til Monitor funksjonelle egenskaper nyisolerte PKD Epitel

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Giant Liposome Forberedelse til Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En kanal Cell-festet Patch-clamp opptak

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Tilberedning av et trans Protein, den Spenning ionekanal, KvAP, inn Giant unilamellær Blemmer for Mikros og Patch Clamp Studier

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-kanal Analyse og Kalsium Imaging i Podocytes av nyisolerte glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...