Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
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Os autores gostariam de agradecer Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para assistência técnica excelente, com experimentos de microscopia. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 HL108880 (a AS), R01 DK095029 (para OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (para OPO) e o Ben J. Lipps Research Fellowship da Sociedade Americana de Nefrologia (para DVI).

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional no Medical College of Wisconsin e University of Health Science Center Texas em Houston e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1 demonstra os passos principais do processo de isolamento e processamento do tecido. Resumidamente, os rins de ratos SD ou PCK são utilizados para o isolamento manual das monocamadas e...

Descrevemos aqui aplicações da técnica de patch-clamp convencional e imagiologia de epifluorescência cálcio para monocamadas epiteliais císticas derivados de um modelo murino de ARPKD genética. O protocolo consiste em três etapas, das quais a maior atenção deve ser dada ao isolamento dos cistos (passo 1.5 da seção de protocolos) e aos estudos eletrofisiológicos. Estes procedimentos fundamentais requerem treinamento extenso e paciência, eo leitor não deve ser frustrado ao mesmo tempo. <p class="jove_co...

Canais de iões desempenhar um papel importante em muitas funções fisiológicas, incluindo crescimento e diferenciação celular. Doenças policística dominante autossómica recessiva e nos rins (ADPKD e ARPKD, respectivamente) são doenças genéticas caracterizadas pelo desenvolvimento de quistos renais cheios de fluido da origem nas células epiteliais tubulares. ADPKD é causada por mutações de genes PKD1 ou PKD2 codificam polycystins 1 e 2, proteínas de membrana envolvidas na regulação da proliferação e diferenciação celular. PKD2, por si só ou como um complexo com PKD1, também funcionar como um catião de Ca2 + -permeable canal 1. As mutações do gene que codifica PKHD1 fibrocystin (uma proteína do tipo receptor-associado cílios envolvidos na tubulogenesis e / ou manutenção da polaridade do epitélio) são o impulso genética da ARPKD 2. Crescimento do cisto é um fenômeno complexo, acompanhado de proliferação perturbado 3,4, angiogênese 5, desdiferenciação e perda de polardade de células tubulares 6-8. Reabsorção defeituoso e secreção aumentada no epitélio cístico contribuir para o acúmulo de líquido no lúmen e cisto expansão 9,10. Fluxo-dependente prejudicada [Ca2 +] i sinalização também tem sido associada a cistogénese durante PKD 11-15. Aqui, nós descrevemos um método adequado para medições de patch-clamp da actividade do canal único e níveis intracelulares de Ca 2+ em monocamadas epiteliais císticas isolados de ratos PCK. Este método foi aplicado com sucesso por nós para caracterizar de actividade do canal de Na + epitelial (ENaC) e 10 [Ca 2+] i induzidas por processos dependentes de Ca 2+ e TRPV4 -permeable purinérgico cascata de sinalização 13. Nestes estudos utilizou-se ratos PCK, um modelo de ARPKD causada por uma mutação espontânea no gene PKHD1. A cepa PCK foi originally derivada a partir de ratos 16 ratos SD, assim, são utilizados como um controlo apropriado para comparação com a estirpe PCK Sprague-Dawley (SD). Como resultado, ambos os segmentos dos néfrons de ratos SD e dutos não dilatado coleta isolados de ratos mesmas PCK pode servir como dois grupos de comparação diferentes para fazer experimentos sobre epitélio cística.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Iniciação cisto e expansão durante a doença renal policística é um processo complexo, caracterizado por anormalidades na proliferação celular tubular, acúmulo de líquido luminal e formação de matriz extracelular. Atividade de canais iônicos e sinalização intracelular de cálcio são parâmetros fisiológicos fundamentais que determinam funções do epitélio tubular. Foi desenvolvido um método adequado para observação em tempo real da actividade de canais de iões com a técnica de patch-clamp e registo de Ca2 + intracelular em monocamadas epiteliais nível isolados de fresco a partir de quistos renais. PCK ratos, um modelo genético de doença renal policística autossômica recessiva (DRPAR), foram usados ​​aqui para ex vivo análise de canais iônicos e fluxo de cálcio. Aqui descrito é um procedimento detalhado passo-a-passo projetado para isolar monocamadas cística e túbulos não dilatado de PCK ou ratos normais Sprague Dawley (SD), e monitorar a atividade de canal único e de Ca 2+ intracelular dinâmica.Este método não exige processamento enzimático e permite a análise de uma configuração nativa isolada de fresco de monocamada epitelial. Além disso, esta técnica é muito sensível a alterações de cálcio intracelular e gera imagens de alta resolução para medições precisas. Finalmente, isolado epitélio cística pode ser ainda utilizado para a coloração com anticorpos ou corantes, preparação de culturas primárias e purificação por vários ensaios bioquímicos.

Potencial envolvimento ENaC em cistogénese tem sido demonstrada em vários estudos que observadas factor de crescimento epidérmico interrompido (FEG) de sinalização na progressão de PKD 22-25 e a reabsorção de sódio anormal na ARPKD modelos murinos e de culturas de tecidos 26-28. Por exemplo, Veizis et al. Mostraram que a absorção sensíveis ao amiloride Na + é diminuída em células CD a partir do modelo não-ortólogas rato BPK de ARPKD 29. Nós demonstra...

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Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Canais de iões expressas em epitélio tubular renal, desempenha um papel significativo na patologia da doença poliquística do rim. Aqui nós descrevemos protocolos experimentais utilizados para a realização de análises e medições de nível de cálcio intracelular de patch-clamp no epitélio cístico recentemente isoladas de rins de roedores.

Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

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