Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Författarna vill tacka Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) och Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) för utmärkt tekniskt bistånd med mikroskopi experiment. Denna studie stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (till OPO) och K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (till OPO) och Ben J. Lipps forskartjänst från American Society of Nephrology (DVI).

De experimentella förfaranden som beskrivs nedan godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Medical College of Wisconsin och University of Texas Health Science Center i Houston och var i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Figur 1 visar huvudstegen i vävnads isolering och förfarande för förädling. I korthet njurar från PCK eller SD-råttor som används för manuell isolering av epitelceller monolager att saml...

Vi beskrivs här tillämpningar av konventionell patch-clamp teknik och epifluorescence kalcium avbildning till cystisk epiteliala monolager som härrör från en mus genetisk modell av ARPKD. Protokollet består av tre steg, varav mest uppmärksamhet bör ägnas åt isoleringen av cystor (steg 1,5 avsnitt protokollen) och de elektrofysiologiska studier. Dessa viktiga förfaranden kräver omfattande utbildning och tålamod, och läsaren ska inte vara frustrerad på en gång. Först och främ...

Jonkanaler spelar en viktig roll i många fysiologiska funktioner, inklusive celltillväxt och differentiering. Autosomalt dominant och recessiva polycystiska njursjukdomar (ADPKD och ARPKD, respektive) är genetiska sjukdomar som kännetecknas av utveckling av njurvätskefyllda cystor av den rörformiga epitelceller ursprung. ADPKD orsakas av mutationer i PKD1 eller PKD2 gener som kodar polycystins 1 och 2, membranproteiner är involverade i regleringen av celltillväxt och differentiering. PKD2 i sig eller som ett komplex med PKD1 fungerar också som en Ca2 + -permeable ning kanal 1. Mutationer av PKHD1 genen som kodar fibrocystin (en cilier associerad receptorliknande protein involverat i tubulogenesis och / eller underhåll av polariteten hos epitel) är den genetiska impulser av ARPKD 2. Cysta tillväxt ett komplext fenomen tillsammans med störd spridning 3,4, angiogenes 5, dedifferentiering och förlust av poläraten av tubulära celler 6-8. Defekt reabsorption och förstärkt sekretion i cystisk epitel bidra till vätskeansamling i lumen och cysta expansions 9,10. Nedsatt flödesberoende [Ca2 +] i signaleringen har också kopplat till cystogenesis under PKD 11-15. Här beskriver vi ett förfarande som är lämpligt för patch-clamp mätningar av enstaka kanalaktivitet och intracellulära Ca2 + nivåer i cystisk epiteliala monoskikt isolerade från PCK råttor. Denna metod har framgångsrikt tillämpats av oss för att karakterisera aktiviteten hos epitelial Na * kanal (ENAC) 10 och [Ca2 +] i -beroende processer som induceras av Ca2 + -permeable TRPV4 och Purinergic signaleringskaskad 13. I dessa studier använde vi PCK råttor, en modell av ARPKD orsakas av en spontan mutation i PKHD1 genen. Den PCK-stammen var originally härrörande från Sprague-Dawley (SD) råttor 16 därigenom SD-råttor används som en lämplig kontroll för jämförelse med PCK stammen. Som ett resultat kan både SD råtta nephron segment och icke-dilaterade samlingsrör isolerade från samma PCK-råttor tjänar som två olika jämförelsegrupper för experiment på cystisk epitel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Cysta initiering och expansion under polycystisk njursjukdom är en komplex process som kännetecknas av avvikelser i tubulär celltillväxt, luminal vätskeansamling och extracellulär matrisbildning. Aktivitet av jonkanaler och intracellulärt kalcium signalering är viktiga fysiologiska parametrar som bestämmer funktioner av tubulärt epitel. Vi utvecklade en metod som lämpar sig för realtidsobservation av jonkanaler aktivitet med patch-clamp-tekniken och registrering av intracellulär Ca2 + nivå i epiteliala monoskikt nyisolerade från njurcystor. PCK råttor, en genetisk modell för autosomal recessiv polycystisk njursjukdom (ARPKD), användes här för ex vivo analys av jonkanaler och kalciumflöde. Beskrivs här är en detaljerad steg-för-steg förfarande för att isolera cystisk monolager och icke-vidgade tubuli från PCK eller normala Sprague Dawley (SD) råttor, och övervaka enda kanal aktivitet och intracellulära Ca2 + dynamik.Den här metoden kräver inte enzymatisk bearbetning och möjliggör analys i en infödd miljö av nyligen isolerade epitelial monolager. Dessutom är denna teknik mycket känslig för intracellulära kalciumförändringar och genererar bilder med hög upplösning för exakta mätningar. Slutligen kan isolerade cystisk epitel användas vidare för färgning med antikroppar eller färgämnen, beredning av primärkulturer och rening av olika biokemiska analyser.

Potentiell ENAC inblandning i cystogenesis har påvisats genom flera studier som observerade sönder epidermal tillväxtfaktor (EGF) signalering i PKD progression 22-25 och onormal natrium reabsorption i ARPKD musmodeller och vävnadskulturer 26-28. Till exempel, Veizis et al. Visade att amilorid känsliga Na + absorption minskas i CD-celler från icke-ortologa BPK musmodell för ARPKD 29. Vi visade nyligen att nedsatt natrium och vatten reabsorption i cystor är en v...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Jonkanaler uttrycks i tubulär epitel spelar en viktig roll i patologin av polycystisk njursjukdom. Här beskriver vi experimentella protokoll som används för att utföra patch-clamp analys och intracellulär kalcium nivå mätningar i cystisk epitel nyisolerade från gnagare njurar.

Implementera Patch Clamp och Live fluorescensmikroskopi att övervaka funktionella egenskaper hos nyisolerade PKD epitel

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Metoder för Kapacitans Patch Clamp inspelningar från Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Registrering av jonkanaler Uttryckt i Xenopus oocyter

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Tryck-polering Pipetter för förbättrad patch-clamp-inspelning

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Jätte liposomberedningen för Imaging och Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En-kanals Cell-ansluten Patch-clamp inspelning

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Beredning av ett transmembranprotein, den spänningskänsliga jonkanaler, KvAP, in Giant enlamellvesiklar för mikroskopi och Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Enkanalig Analys och Kalcium Imaging i podocyter av nyisolerade Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...