Name: implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma (AS) R01 HL108880 (OPO kadar) R01 DK095029 ve (TSP) K99 HL116603 (TSP) Ulusal Böbrek Vakfı IG1724, (OPO kadar) Amerikan Kalp Derneği 13GRNT16220002 ve hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu.

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Wisconsin ve Houston Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi Tıp Koleji&#39;nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca idi. Şekil 1 doku izolasyon ve işleme prosedürünün ana adımları gösterir. Kısaca, PCK veya SD sıçanların böbrekleri sağlıklı olmayan aranan tübüllerden veya kistleri ya oluklar toplama epitel mo...

Biz ORPBH bir murin genetik modelinde elde edilen kistik epitel mono tabakaları için geleneksel kumanda klemp tekniği ve epifloresans kalsiyum görüntüleme uygulamaları tarif. Protokol en dikkat kistleri (protokoller bölümünün adım 1.5) izolasyonuna ve elektrofizyolojik çalışmalar ödenmesi gereken üç adımda, oluşur. Bu anahtar prosedürler kapsamlı eğitim ve sabır gerektiren ve okuyucu seferde hüsrana olmamalıdır. Her şeyden önce, en dikkat kist tek tabakalı izola...

İyon kanalları, hücre büyümesi ve farklılaşması dahil olmak üzere bir çok fizyolojik işlevler, önemli bir rol oynamaktadır. Otozomal dominant ve resesif polikistik böbrek hastalığı (sırasıyla ADPKD ve ORPBH) tübüler epitel hücre kökenli böbrek sıvı dolu kistlerin gelişimi ile karakterize genetik bozukluklardır. Polikistik böbrek polycystins 1 ve hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesinde rol oynayan 2, zar proteinlerini kodlayan PKD1 ya PKD2 genlerin mutasyonu neden olmaktadır. Kendi başına veya PKD1 ile bir kompleks olarak PKD2 da Ca2 + geçirgen katyon kanalı 1 olarak işlev görür. PKHD1 kodlayan genin Fibrosistin (tubulogenesis ve / veya epitel polarite devamını sağlayan bir kirpikler ilişkili reseptör benzeri protein) mutasyonları ORPBH 2 genetik ivme bulunmaktadır. Kist büyümesi karmaşık bir fenomen rahatsız çoğalması 3,4, anjiyogenez 5 dediferansiyasyon ve kutupsal kaybı eşlik etmektedirtübüler hücrelerin 6-8 lık. Kistik epitel Arızalı reabsorbsiyon ve artırılmış salgı lümen ve kist genişlemesi 9,10 sıvı birikimine katkıda bulunur. Bozulmuş akım bağımlı [Ca 2 +] i sinyal de PKD 11-15 döneminde cystogenesis ile bağlantılı olmuştur. Burada, tek bir kanal aktivitesi ve PCK sıçanlardan izole edilen kistik epitel mono tabakaları, hücre içi Ca + 2 seviyeleri patch-clamp ölçümleri için uygun bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, başarılı bir epitelyal Na + kanalı (ENaC) 10 aktivitesinin karakterize edilmesi için tarafımızdan uygulandı ve [Ca2 +] i Ca2 + geçirgen TRPV4 ve purinerjik sinyal kaskadı 13 tarafından uyarılan işlemleri bağımlı. Bu çalışmalarda, biz PCK fareleri PKHD1 geninde kendiliğinden mutasyon nedeniyle ORPBH bir model kullanılır. PCK zorlanma originall olduSprague-Davvley (SD) sıçanlarda 16 böylece SD sıçanlarına PCK soyu ile karşılaştırma için uygun bir kontrol olarak kullanılır türetilen y. Bunun bir sonucu olarak, aynı PCK sıçanlardan izole edilen sıçan SD nefron segment ve Genişletilmemiş toplama kanalları hem kistik epitelyum üzerinde deneyler için iki farklı karşılaştırma grupları olarak kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Polikistik böbrek hastalığı sırasında Kist başlatma ve genişletme tübüler hücre çoğalması, lümen sıvı birikimi ve hücre dışı matriks oluşumu anormallikleri ile karakterize karmaşık bir süreçtir. Iyon kanalları ve hücre içi kalsiyum sinyalizasyon aktivitesi tübüler epitelyum işlevlerini belirleyen temel fizyolojik parametrelerdir. Biz taze böbrek kistleri izole epitel mono tabakaları hücre içi Ca 2 + düzeyinin patch-kelepçe tekniği ve kayıt iyon kanalları aktivitenin gerçek zamanlı gözlem için uygun bir yöntem geliştirdi. PCK sıçan, otozomal resesif polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek hastalığı) genetik bir modelidir, iyon kanalları ve kalsiyum akışının ex vivo analiz için kullanılmıştır. Burada anlatılan tek kanal aktivitesini ve hücre içi Ca + 2 dinamiklerini kistik mono tabakaları ve PCK veya normal Sprague Dawley (SD) sıçanların olmayan dilate tübüller izole ve izlemek için tasarlanmıştır ayrıntılı bir adım-adım bir yöntemdir.Bu yöntem, enzimatik işleme gerektiren ve taze izole epitel Tek tabakalı bir yerli ortamda analiz izin vermez. Ayrıca, bu teknik, hücre içi kalsiyum değişikliklere çok duyarlı olduğu ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir. Son olarak, izole edilmiş bir kistik epitel Antikorların ya da boyalar, çeşitli biyokimyasal deneyler için birincil kültürleri hazırlanması ve saflaştırılması ile lekeleme için kullanılabilir.

Cystogenesis potansiyel ENaC tutulumu ORPBH murin modelleri ve doku kültürleri 26-28 PKD ilerlemesi 22-25 ve anormal sodyum reabzorpsiyonunda sinyal kesintiye epidermal büyüme faktörü (EGF) gözlemlenen çeşitli çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. Örneğin, Veizis ve ark., Amiloride duyarlı Na + absorpsiyon ORPBH 29 olmayan ortolog BPK fare modelinde CD hücrelerinde azalmış olduğunu göstermiştir. Biz son zamanlarda kistleri bozulmuş sodyum ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...