Name: a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice
Uploaded: 2015-11-23T15:00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice at JoVE.co

This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL&#8217;s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

<ol>
	<li>Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+cell+separation+and+sorting+in+microfluidic+systems.">Label free cell separation and sorting in microfluidic systems.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3249-3267 (2010).</li><li>Lenshof, A., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+separation+of+cells+and+particles+in+microfluidic+systems.">Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems.</a> Chemical Society Reviews. 39 (3), 1203-1217 (2010).</li><li>Sajeesh, P., Sen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+separation+and+sorting+in+microfluidic+devices+a+review.">Particle separation and sorting in microfluidic devices a review.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 17 (1), 1-52 (2014).</li><li>Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+cell+separation.">Microfluidics for cell separation.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 48 (10), 999-1014 (2010).</li><li>McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+lateral+displacement+for+particle+separation+a+review.">Deterministic lateral displacement for particle separation a review.</a> Lab Chip. 14 (21), 4139-4158 (2014).</li><li>Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+separation+of+bioparticles+in+microdevices+A+review.">Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review.</a> ELECTROPHORESIS. 35 (5), 691-713 (2014).</li><li>Jin, C., McFaul, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+label+free+separation+of+circulating+tumor+cells+from+historical+foundations+to+recent+developments.">Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 32 (2014).</li><li>Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa C&#225;novas, G., Knoerzer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+suspensions+and+emulsions+via+ultrasonic+standing+waves+&#8211;+A+review.">Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves &#8211; A review.</a> Ultrasonics Sonochemistry. 21 (6), 2151-2164 (2014).</li><li>Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+microfluidics+in+waterborne+pathogen+monitoring+A+review.">Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review.</a> Water Research. 55, 256-271 (2014).</li><li>Mariella Jr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+the+weak+link+in+microfluidics-based+biodetection.">Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection.</a> Biomedical microdevices. 10 (6), 777-784 (2008).</li><li>Gor&#8217;kov, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustic+field+in+an+ideal+fluid.">On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid.</a> Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).</li><li>Settnes, M., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustical+field+in+a+viscous+fluid.">Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid.</a> Physical Review E. 85 (1), 016327 (2012).</li><li>Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+radiation+and+streaming-induced+microparticle+velocities+determined+by+microparticle+image+velocimetry+in+an+ultrasound+symmetry+plane.">Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane.</a> Physical Review E. 86 (5), (2012).</li><li>Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidics+7+The+acoustic+radiation+force+on+small+particles.">Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles.</a> Lab Chip. 12 (6), 1014-1021 (2012).</li><li>Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+focusing+with+engineered+node+locations+for+high+performance+microfluidic+particle+separation.">Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation.</a> Analyst. 139 (5), 1192-1200 (2014).</li><li>Fong, E. J., Bora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+Variable+Node+Position+in+a+High+Throughput+Acoustofluidic+Device.">Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device.</a> Micro Total Analysis Systems. , 1184-1186 (2014).</li><li>Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+tuning+of+acoustofluidic+pressure+nodes+by+altering+net+sonic+velocity+enables+high-throughput+efficient+cell+sorting.">Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting.</a> Lab on a Chip. 15 (4), 1000-1003 (2015).</li><li>Franssila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Reactive+Ion+Etching.">Deep Reactive Ion Etching.</a> Introduction to Microfabrication. , 255-270 (2010).</li><li>Sharma Rao, B., Hashim, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Photomask+Design+Using+CAD+Software+for+Application+in+Lab+On+Chip+Biomedical+Nanodiagnostics.">Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics.</a> Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).</li><li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Large+Scale+Integration+The+Evolution+of+Design+Rules+for+Biological+Automation.">Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36 (1), 213-231 (2007).</li><li>Madou, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. , (2002).</li><li>Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+based+packaging+platform+for+hybrid+microfluidic+systems.">Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems.</a> Biomedical Microdevices. 4 (4), 301-308 (2002).</li><li>Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+specific+flow+control+in+microfluidic+circuits+with+passive+elastomeric+features.">Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features.</a> Nature Physics. 5 (3), 231-235 (2009).</li><li>Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+pressure+driven+microfluidic+networks+using+electric+circuit+analogy.">Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 515-545 (2012).</li><li>Mittelbrunn, M., Guti&#233;rrez V&#225;zquez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA+loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen+presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282 (2011).</li><li>Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+entry+of+dengue+virus+into+Aedes+albopictus+mosquito+cells+is+dependent+on+clathrin+mediated+endocytosis.">Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis.</a> Journal of General Virology. 89 (2), 474-484 (2008).</li><li>Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+Characterization+and+In+Vitro+Culture+of+Highly+Divergent+Arenaviruses+from+Boa+Constrictors+and+Annulated+Tree+Boas+Candidate+Etiological+Agents+for+Snake+Inclusion+Body+Disease.">Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease.</a> 3 (4), e00180 12 (2012).</li><li>Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+Evaluation+of+Fast+Microfluidic+Thermal+Lysis+of+Bacteria+for+Diagnostic+Sample+Preparation.">Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation.</a> Diagnostics. 3 (1), 105-116 (2013).</li><li>Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+move+to+microfluidics+for+protein+analysis.">Why the move to microfluidics for protein analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (1), 31-37 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Denne protokollen presenterer systemnivå integrasjon av microfluidic enheter til macroscale utstyr for å utføre automatisert biologisk utvalgets behandling. Modulariteten av denne plattformen gjør det mulig å kunne tilpasses en hvilken som helst kontinuerlig strømningsanordning, og, som et eksempel, fokuserer den presenterte protokollen på å karakterisere og å optimalisere ytelsen til en acoustofluidic partikkelseparasjonsanordning. Tre store fordeler av denne protokollen er uthevet: (i) modularitet og chip-til-verden grensesnitt, (ii) robust karakterisering av ytelse fra enheten, og (iii) automatisk behandling av nøyaktig oppmålte prøvevolum for partikkelseparasjon. jeg. Modularitet og chip-til-verden grensesnitt Som vist i figur 2, er microfluidic brikken montert på en tilpasset brødfjel for enkelt å passe inn i en objektbord for direkte observasjon. Breadboard inneholder # 6-40 UNF gjengede hull på en 5 mm-banen rutenett, enabling brikken som skal sikres, og væskekoplinger skal gjøres. Væsken tilkoblinger er TITT rør med maskinerte ender, som tetning mot fluidic chip med en gummi ansikt-pakning og en rustfritt stål krage. Dette grensesnittet ordningen gjør for enkel chip utskifting og rask enhet redesign, krever få eller ingen endringer i andre systemkomponenter, levert chip fotavtrykk er i samsvar med rutenett format. For eksempel har vi brukt denne plattformen med microfluidic chips for kontinuerlig strømning elektroforese, termisk cellelysis, 29 hurtig blanding av reagenser for kjemisk syntese, og encellede fangst og avhør. ii. Robust karakterisering av enhetens ytelse For å optimalisere ytelsen til alle mikrofluidseparasjonsenhet, sin drift må først bli grundig karakterisert. Systemet er beskrevet her støtter utviklingen av raske og automatiserte protokoller for å gjøre dette. For den spesifikke example av akustiske fokusere enheter, fokuserings kvalitet, driftsfrekvens, og stillingen fokusert partikler i mikrofluidkanalen må måles for hver enkelt enhet. Disse målingene krever sveiper gjennom en rekke piezoceramic driv frekvenser, spenninger og strømningsrater, for å identifisere de optimale parameterkombinasjoner for høy kvalitet separasjon. Den presenterte protokollen varierer automatisk avstembare disse parametrene og fanger opp den aktuelle data- dvs. fluorescerende bilder av partiklene som strømmer i kanalen som er etterbehandlet for å generere de nødvendige målinger av partikkel fokus kvalitet, frekvens og posisjon (figur 3). Full karakterisering av akustisk ytelse enheten krever gjenta trinn 4.4 og 4.5 etter behov under ulike eksperimentelle forhold. For eksempel er den absolutte fokuserte posisjonen av et chip funnet ved å kjøre frekvens scan ved relativt lave strømningshastigheter og høy spennings for å sikre fullstendig migrering til noden sted. I tillegg kan slike frekvens skanninger vurdere kvaliteten på enheten enheten (når det kjøres med isopor perler av kjent størrelse), eller å finne ut hvordan en tidligere ukjent partikkel type vil oppføre seg i systemet (etter en chip har vært preget med perler). En brikke med god energioverføring fra piezoceramic til mikrofluidkanalen vil resultere i tett fokusering ved høye strømningshastigheter (&gt; 1 ml / min) og lav spenning (V pp 12-15), mens de med dårlig energioverføringen ikke vil fokusere enda ved lave hastigheter (&lt;100 mL / min) og høye spenninger (&gt; 20 V pp). Vi har funnet at intim kontakt mellom mikrofluid chip og piezoceramic er kritisk for effektiv energioverføring inn i fluidet. Videre undersøkelser av optimal metode for liming microfluidic chip og piezoceramic vil gjøre det mulig pålitelig produksjon av høy ytelse enheter. Til slutt, en komplettbilde av et acoustophoretic enhetens drift kan oppnås ved å kombinere de bildebaserte frekvensskannings målinger av trinn 4 (og fig 3) med partikkeltellinger oppsamlet fra SPO og LPO som funksjoner av de relevante driftsparametre, fra separasjons eksperimenter utført med mikrokuler , som beskrevet i trinn 5. Som vist i figur 6, kan en slik rekke automatiske eksperimenter hurtig karakterisere et individ enhetens ytelse og tunability, informerer brukeren av den optimale parameter plass for drift av enheten for partikkelseparasjon. iii. Automatisert små-utvalgets behandling for partikkelseparasjon For vellykket og nøyaktig mikrofluid chip-baserte type behandling, er det viktig å pålitelig og nøyaktig måler, belastning, levere og samle volumene av fluid etter hvert som de passerer gjennom. Denne nøyaktighet er særlig viktig når prøvevolumet er lite(~ 0,1-1 ml), noe som er vanlig i klinisk eller forsknings laboratoriet 30 Presis prøvehåndtering er utfordrende i tradisjonelle microfluidic eksperimenter som benytter manuell tilbaketrekking av prøven inn i en sprøyte og infusjon i en enhet uten tilbakeføring av når prøven. har blitt skilt, og når det skal samles. Den presenterte protokollen benytter automatisert prøve spiral lasting og Levering er kombinert med tilbakemelding i sanntid fra sensorer for å aktivere reproduserbare separasjoner av små prøvevolumer. Figur 5 viser de strømningsprofiler målt på SPO og LPO fra en typisk separasjon eksperiment. Først blir ledende buffer på minst 35 ul belastet for å sikre stabil strømning før prøven når den akustiske chip. Prøvevolumer mindre enn 100 ul er ikke anbefalt for denne systemkonfigurasjon, fordi prøvefortynning på grunn av det ledende bufferen blir for stor. En plugg av luft blir brukt ved begynnelsen av the injeksjon før den ledende buffer for å separere prøven pluggen fra den væske som følger, hindrer blanding og fortynning av prøven, og tjener som en indikator for de sensorer. Etter en innledende transient som fluid begynner å bevege seg gjennom systemet, skarp pigg signaler i begge utløp indikere passeringen av den første luftboble. Disse transientene blir etterfulgt av en lang periode med stabil strømning som prøven strømmer gjennom systemet, og deretter en annen spiss når den andre luftboble passerer, og til slutt en eventuell reduksjon i strømningshastigheten til null etter at sprøyten pumpen stopper. Passasjen av luft gjennom pluggene sensorer blir benyttet som triggerpunkter for å skifte ventilene for å starte og stoppe prøvetaking, og dermed minimere tapt prøven og fortynning av ikke-prøvefluidvolumer. Lukket-sløyfe måling av behandlet prøvevolum eliminerer behovet for å omprogrammere disse verdiene før starten av eksperimentet hver gang inngangs prøven endres. Denne funksjonen erspesielt viktig når prøvevolumet er begrenset, for eksempel i tilfelle av mange kliniske prøver. Sanntidsvæskeovervåkning bistår også i feilsøking; en dårlig run (f.eks, en tresko forming i ett av utløpene) er umiddelbart tydelig fra de resulterende strømningsprofiler, som vist på figur 5b. For å demonstrere fleksibiliteten og effektiviteten av acoustofluidic separasjon bruke presenteres systemarkitektur, renset DENV og GGV virus aksjer ble tilsatt i celle aksjer og adskilt med behandling gjennom microfluidic chip. Figur 7a viser at Raji celler ble godt adskilt fra virus, som 97 % av Raji-celler som kommer ut av brikken ble funnet å være i LPO, for derved å etterlate et høyt anriket prøve av DENV i SPO. Til sammenligning, effektiviteten av DENV separasjon var lavere, med 70% av DENV som kommer ut av brikken befinner seg i samme SPO. Dette kan tilbakeføres til svak konvektiv blanding indusert av omdreininger av separatipå kanal, men mer sannsynlig at noen DENV partikler som migrerer sammen med Raji-celler i LPO. Celler migrerer lateralt over strømlinjene dra litt væske med dem, selv ved lave Reynolds tall. Ved denne mekanisme, så vel som ikke-spesifikk overflateadsorpsjon, viruspartikler overføres til LPO. Likevel er svært anriket prøve av DENV i SPO en betydelig fordel, for eksempel når de novo-sekvensering blir brukt til å detektere og identifisere virus. Figur 7b viser at i en forsøkskjøring ble bare omtrent 70% av Boa celler som kommer ut av brikken befinner seg i samme LPO, sammenlignet med nesten 100% separasjonseffektivitet for Raji-celler. Forskjellen i separasjonsevne mellom de to celletypene kan skyldes en mindre gjennomsnittlig størrelse eller en lavere tetthet av Boa celler sammenlignet med Raji-celler, og derfor resulterer i mindre akustiske krefter. For å bekrefte eller avkrefte disse antakelser, størrelse, tetthet og morfologi av Boaceller i suspensjon (som normalt vokser tilhenger) fra Boa celler må måles nøyaktig, en innsats for videre etterforskning. I de samme eksperimentene, på samme måte som forsøkene med DENV, mesteparten av den gjenvunnede GGV gått ut fra SPO, noe som indikerer en berikelse av viral fraksjon. De presenterte data markere iboende utfordringene i ingeniør bredt-aktuelle plattformer for behandling av en rekke biologiske prøver. Viktigere, kan de biologiske interaksjoner begynner å spille en like stor rolle som de fysiske og mekaniske påvirkninger. Men disse foreløpige forsøkene også demonstrere makt og løfte om å bruke denne systemarkitektur for utvalgets behandling i kliniske og forskningssøknader. Som en robust, godt karakterisert utviklet system, gir denne plattformen muligheten til å søke svar på nye vitenskapelige spørsmål.

Eksempel separering og fraksjonering er en av de mest lovende anvendelsesområder for microfluidic teknologier. Slike prøvehåndtering trinnene er integrert for effektiv klinisk diagnostikk, terapi utvikling, biosurveillance innsats og fremgang i life science forskning og teknologi. En myriade microfluidic separasjons strategier har blitt demonstrert for væske suspendert partikler og kolloider, samt for kjemiske og biologiske arter; flere vurderinger gi oversikter av nyere fremskritt og utviklingen i disse områdene 1 - 9. Selv om mange av disse microfluidic separasjonsteknologier (heretter referert til som &quot;Core-enheter&quot;) er blitt grundig karakterisert, er det få rapporter anses prøven separasjonen problem på et systemnivå. Core Devices er typisk individuelle centimeter stilt chips, integreres med fluor tubing, med væske levert av en forskyvning eller trykkpumpe.Likevel, hvis løftet om MicroFluidics - blant annet økt automatisering, pålitelighet og reduksjon i prøvevolum - er å bli virkelighet, minst en tilsvarende innsats skal være viet til utformingen av et fullstendig skille system der Core Device er integrert . I tillegg er en stor utfordring for microfluidic tilnærminger til biodetection makro til mikro-grensesnitt. Dette gjelder ikke bare for de fysiske &quot;verden-til-chip&quot; forbindelser i et mikrofluid enhet til mesoklimatisk komponenter, og til mismatch mellom typiske kliniske eller analyseprøvevolumer (~ 0,1-10 ml) og det indre volum av microfluidic chips (~ 0,01 til 10 pl), men også til de statistiske prøvetakings begrensninger som oppstår fra disse brodannende størrelse skalaer. Disse problemene bidrar til oppfatningen om at prøven pre-prosessering og tilberedning er de &quot;svake leddet&quot; av biodetection. 10 Plattformen er beskrevet i dette arbeidet taKES store skritt mot å adressere disse utfordringene. Tar en systemnivå syn detaljer denne protokollen pålitelig prosessering av nettopp vannmåler analytisk stilt volumer (varierer fra 0,15 til 1,5 ml) på ~ 10 min tidsfrister. Dette er en &quot;one-button&quot; operasjon: når kilden hetteglasset med prøven og målet ampuller for brøkdel samlingen er plassert inn i systemet, starter &quot;run&quot; -kommandoen prosedyren, og alle trinnene er datastyrt. Ved slutten av en kjøring, kan oppsamlingshetteglass fjernes fra systemet nedstrøms for analyse av de separerte fraksjoner. Innretningens kjerne i dette system er en acoustophoresis brikke som ekstraherer pattedyrcellestørrelse (5-20 um) partikler fra prøven. Acoustophoretic separasjon er valgt her først og fremst fordi det er høy gjennomstrømming (opp til 100s av mL / min), etikett-fri, og ikke-kontakt, og tilbyr dermed fordeler i å skille levedyktig Viruses fra celler som få andre microfluidic teknikker kan matche. Fysikken i akustisk partikkel fokusering har blitt grundig beskrevet, 11 - 13, og er ikke fokus for denne protokollen, men en kort oppsummering av de underliggende begrepene følger for å hjelpe til med å forstå søknaden til microfluidic separasjon. Ultralyd stående bølger resonnerende i væskefylte mikro produsere trykkfeltene, noe som gir opphav til krefter som driver partiklene mot noder med lavt trykk. Kraften størrelse er avhengig av partikkelens volum, og på en akustisk steilhetsfaktor utledet fra de relative tettheter og compressibilities av partikkelen og den suspenderende væske. 14 Som sådan akustisk fokusering er ideelt egnet til separering av celle-størrelse (~ 7-15 mikrometer) fra virus-sized (~ 50-200 nm) partikler. De større partikler migrerer mot en trykk node; men siden kraften størrelse er meget liten forpartikler mindre enn 2-3 um, disse små partikler eller oppløste arter knapt bevege seg i det hele tatt. Vår spesifikk implementering av akustiske atskillelse, som tidligere beskrevet, inneholder 15 en tynn vegg for å dele fluidkanalen og tillater fleksibel, asymmetrisk plassering av fokuseringsstilling. Dette gir økt fleksibilitet i enheten design, og ytelesesfordelene-inkludert økt separasjon kvalitet og hastighet-er fullstendig beskrevet andre steder. 16,17 Men en stor fordel av systemet-level design tilnærming beskrevet i dette arbeidet er at det er tilpasningsdyktig til et stort utvalg av microfluidic Kjerne Devices. For eksempel kan de fleste andre kontinuerlig strømning separasjonsmåter, inkludert treghet, strømningsfeltfraksjonering, deterministisk lateral forskyvning (DLD), og forskjellige typer av elektrokinetiske anordninger lett bli innarbeidet, med passende justeringer gjøres for å ta høyde for endringer i innløp / utløp konfigurasjon , strømningshastigheter,og prøvevolumer. Enheter med ulike typer on-chip felt (elektriske, magnetiske) eller gradienter (termisk, kjemisk) kan kreve ytterligere forbindelser til chip, eller integrering av ekstra maskinvare, som denne plattformen plass. Denne protokollen gir trinnene som kreves for å designe en mikrofluidseparasjonsenhet, og å dikte silisium-glass chips ved dypreaktiv etsing (DRIE, en plasma-etseprosess tilgjengelig i mange microfabrication fasiliteter, som bruker vekslende sykluser av etsing og passivisering å oppnå dyp funksjoner med vertikale sidevegger 18). Deretter beskriver vi karakterisering av acoustofluidic enheten for å bestemme de optimale operasjonsparametere for separasjon, og til slutt detalj fullt integrert separasjonssystem, og fremgangsmåten for behandling av biologiske prøver. Typiske enhet karakterisering resultater og utvalgets behandling av data blir deretter presentert og diskutert, og de viktigste fordelene med denne hensiktsach er uthevet, inkludert modularitet, robusthet, presisjon og automatisering.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Polished Silicon Wafer</td>
			<td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td>100 mm &#60;100&#62;&#160; prime wafer</td>
			<td>1-20 ohm-cm, 495 +/- 25&#181;m Double-side polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wafer</td>
			<td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td>
			<td>100mmx0.5mm Boro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 1518</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 1518</td>
			<td>Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 4620</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 4620</td>
			<td>Photoresist to define fluidic and via mask patterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE plasma etcher</td>
			<td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td>
			<td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Bonder</td>
			<td>Electronic Visions Group,&#160; St.Florian am Inn, Austria</td>
			<td>EVG 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Kulicke &#38; Soffa Industries, Singapore</td>
			<td>K&#38;S 982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy kit</td>
			<td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td>
			<td>EPO-TEK 301</td>
			<td>Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT piezoceramic&#160;</td>
			<td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td>
			<td>PSI-5A4E</td>
			<td>37.5 &#215; 10 &#215; 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td>
			<td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td>
			<td>UL1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part silver epoxy&#160;</td>
			<td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td>
			<td>8331</td>
			<td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-edit</td>
			<td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td>
			<td>Ledit v15.1 64-bit</td>
			<td>CAD software for mask layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>PHD ULTRA Series, 703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringes</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer to Threaded port adapter</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Connects syringe to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-623</td>
			<td>Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.&#160; Can also use webbed&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160; 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-202</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; OD Fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1912L</td>
			<td>Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.&#160; Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03&#34; ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ID fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1476-20</td>
			<td>Used for Flow restrictors: 0.006&#34; ID, 1/16&#34; OD FEP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connects from chip to fluoropolymer tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling fan</td>
			<td>Multicomp, Leeds, England</td>
			<td>MC19663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF amplifier</td>
			<td>ENI, Rochester, NY</td>
			<td>325 LA</td>
			<td>Must be able to amplify signals from &#60;1V&#160; in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td>
			<td>CoolSnap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axiovert S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Tech, VT, USA</td>
			<td>SP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, 10x</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>ACHROPLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td>
			<td>TDS3014B</td>
			<td>To monitor voltage output by RF amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks, Natick, MA, USA</td>
			<td>R2014a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW</td>
			<td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td>
			<td>SITK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 &#181;m Beads</td>
			<td>Bangs Laboratory, IN, USA</td>
			<td>FS06F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Additional materials required for Step 5: Automated Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport valves</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>C25Z-3180EUHA</td>
			<td>In the current configuration 4 valves are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensors</td>
			<td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td>
			<td>SLI-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03&#34; ID</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1902L and 1912L</td>
			<td>High purity PFA preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160;</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZN1PK-10</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and valves.&#160; Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZGF1PK-10</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and valves.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td>LabVIEW Professional Development system</td>
			<td>Laboratory Automation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raji Cells</td>
			<td>ATTC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CCL86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boa Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Jose Pena at LLNL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Z2</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td>Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice

En stor fordel med microfluidic anordninger er muligheten til å manipulere små prøvevolumer, og dermed redusere reagens avfall og bevare verdifulle prøven. Men for å oppnå robust prøven manipulering er det nødvendig å ta enheten integrasjon med makromiljø. For å realisere repeterbare, følsom partikkelseparasjon med microfluidic enheter, presenterer denne protokollen et komplett automatisert og integrert mikrofluid plattform som gjør det mulig presis behandling av 0.15-1.5 ml prøver ved hjelp microfluidic enheter. Viktige aspekter ved dette systemet inkluderer modulær enhet layout og robuste inventar resulterer i pålitelig og fleksibel verden å chip-tilkoblinger, og helautomatisk væskehåndtering som oppnår lukket prøvetaking, system rengjøring og grunning skritt for å sikre repeterbare drift. Ulike microfluidic enheter kan brukes om hverandre med denne arkitekturen. Her vi innlemme en acoustofluidic enhet, detalj sin characterizasjon, ytelse optimalisering, og demonstrere bruken for størrelsen-separasjon av biologiske prøver. Ved å bruke sanntid tilbakemelding under separasjons eksperimenter, er prøvetaking optimalisert for å bevare og konsentrere prøven. Selv krever integrering av flere stykker av utstyr, fordelene med denne arkitekturen inkluderer muligheten til å behandle ukjente prøver uten ekstra system optimalisering, brukervennlighet erstatningsenhet, og presis, robust utvalgets behandling.

Viktige trekk ved den akustiske-mikrofluid enhet utforming er fremhevet i figur 1, og beskrevet i detalj et annet sted. 15 I korte trekk, to fluidstrømmer strømnings side-ved-side i en separasjonskanal, atskilt fra en parallell omløpskanal med en tynn silikon vegg. Siden den primære strålingsstyrken størrelse skaleres med partikkelvolum, store partikler migrerer ut av den blandede-sample inngangsstrømmen mot det akustiske trykket node ligger i den tilstøtende utvinning fluidstrømmen, mens små partikler forblir i det opprinnelige strømmen (figur 1 B, C). Den deles tokanals arkitektur forbedrer partikkelseparasjon 17 og tillater justering av node posisjon ved hjelp av ulike bypass kanal væsker. 16 fluidic brødfjel og inventar gir en robust plattform for verden å chip-tilkoblinger, og modulær design muliggjør rask endring mellom fluid chips (figur 2). Dette configuration likeså gjør reversible forbindelser væske, som sel opp til 1000 psi, gjøres raskt og pålitelig (figur 2B, E). Resonansfrekvens f res av en chip kan anslås ved hjelp av enkle 1D analytiske beregninger (se trinn 1.1.1). Fra en mer fullstendig 2D finite-element-modell av vår enhet tverrsnitt, 16 den forventede posisjon for fokuserings 2-node resonans er 225 mikrometer fra veggen og den forventede frekvens er 1,68 MHz. Imidlertid kan f res av virkelige enheter varierer med ± 100 kHz, avhengig av driftstemperaturen og kobling av langsgående og sideveis resonanser. Derfor, etter montasje-enhet, f res må empirisk verifiseres ved aktuelle strømningshastigheter og piezo drivspenninger, som beskrevet i trinn 4 av protokollen. Figur 3 viser representative frekvensskanning tatt på 200 ul / min,<html> med vann i de viktigste og bypass kanaler, og 20 V pp levert til piezo. Når koplingen mellom den piezo og mikrofluid anordning er god, vil partiklene fokusere tett ved resonansfrekvensen, noe som resulterer i en klar topp i det fluorescerende intensitet og migrering til den forventede fokuseringsposisjon (figur 3A). I motsetning til dette, når det er dårlig kobling, vil partiklene ikke fokusere godt og frekvensskannings resultatene vil være i likhet med figur 3B. I slike anordninger kan det piezo transduseren må re-montert, hvis en reversibel klebemiddel har blitt brukt; ellers er denne enheten uegnet når høy kvalitet med fokus eller rask flyt er avgjørende for det aktuelle programmet. Dataene i figur 3 informere om valg av driftsfrekvensen for etterfølgende eksperimenter, og spenningen og strømningshastighetsområdet er tilgjengelig for effektiv separering partikler. filer / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Figur 5. Automatisert prøvebehandling. (A) Skjematisk av prøven som er lagt i prøven spolen. (B) Representative strømningsprofil for en vellykket separasjons eksperiment. (C) Strømnings profil fra en separasjon kjøre under hvilket SPO uttaket tett på ca 220 sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Etter identifisering av flis som er effektive separatorer, blir de inkorporert i systemet vist i figur 4. Totalt system slagvolum blir minimalisert ved bruk av rør med 0,01 &quot;indre diameter langs hovedstrømningsbanen (blå linje). Figur 5A illustrerer make-up av en typisk prøve plugg tilført gjennom systemet. En liten mengde &quot;ledende buffer&quot; (~ 35 mL) kreves for å precede prøven i strømmen for å eliminere svingninger i strømnings mens prøven beveger seg gjennom separasjons brikken. Figur 5B viser strømningsdata som følge av et vellykket automatisert akustisk atskillelse eksperiment. Viktige egenskaper for en vellykket kjøre omfatter: (1) en forbigående økning i strømningshastighet i både LPO og SPO som trykket bygger og fluid begynner å strømme gjennom systemet, (2) en skarp pigg som angir passasje av en luftboble (i innfelt viser en utvidet profil av en enkelt boble), som skal komme på SPO før LPO grunn av den skjeve strømmen fra de to utløp, (3) stabil strømning gjennom begge utløp mellom de to luftbobler som prøven beveger seg gjennom systemet, og (4) en gradvis reduksjon i strømningshastigheten i begge utløp etter at hele prøvevolumet blir levert til systemet. Problematiske løper er umiddelbart synlig fra strømningsprofiler som ligner på figur 5C, hvor det fremgår at den SPO ble tett etter omtrent 220 sekunder. I thi<html> s Ved en rense prosedyre lik den som er beskrevet i trinn 5,3 bør kjøres for å rense kanalen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Figur 6. Device Tunbarhet: partikkelstørrelse og Spenning Effects. Prosent av polystyren-mikrokuler ble ekstrahert på LPO er avhengig av partikkelstørrelsen og spenningen som leveres til den piezoceramic. Hver linje svarer til en annen driftsspenning på resonansfrekvens, bestemt som beskrevet i trinn 4. Total strømningsrate gjennom anordningen er 200 mL / min, med anvendt driv frekvenser mellom 1,62 og 1,64 MHz. Feilstolpene representerer standardavviket av minst tre separate forsøk. Reproduseres og modifisert med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry fra http://pubs.rsc.org / no / Innhold / ArticleLanding / 2 014 / AN / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 6 viser samlet separasjons resultater ved hjelp av ulike polystyren partikkelstørrelser og piezo kjører spenninger som viser rammebetingelsene som er nødvendige for effektiv separasjon. Generelt er høyere spenninger (dvs. større akustiske krefter) som kreves for å trekke ut mindre partikler, som forventet. Drivspenninger ikke kan ubestemt tid økes, men på grunn av større varmetap og øker effekten av akustisk streaming. 13 Plottet tjener som en generell veiledning for partikkelseparasjon-partikkelstørrelser som viser signifikant forskjellig utvinning ved en bestemt drivspenning (for eksempel 10- og 2-mikrometer partikler på 8,8 V pp) vil skille godt. Vanligvis partikkelpopulasjoner med stor størrelse forskjell, for eksempel virus (~ 100 nm) og celler (~ 10 nm) kan skilles raskt og effektivt, som kan celler av different størrelser (f.eks 6-8 mikrometer skiveformede erytrocytter og 8-15 mikrometer leukocytter). De spesifikke betingelser som kreves for å arbeide med andre celletyper, må bestemmes empirisk, som celle form, tetthet og sammentrykkbarhet påvirke dens akustiske kontrast, i tillegg til cellestørrelsen. For dette formål er fremgangsmåten i trinn 4 er nyttig for å bestemme brukbare separasjonsbetingelser for en hvilken som helst ny celle eller partikkeltype, og ikke bare for å vurdere kvaliteten av en spesiell acoustophoresis enhet. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Figur 7. Separasjon Effektivitet av Cell-Virus Spiked Samples. Separasjon resultater fra (A) Raji celler tilsatt Dengue virus (DENV) og (B) Raji celler og Boa nyreceller tilsatt Golden Gate Virus (GGV). Prosentandeler innsamlede er definert som den fraksjon av virus eller celler som går ut fra en spesifikkutløp i forhold til den totale mengden som kommer ut av chip. De feilfelt for (A) er standardavviket for 3 forsøk, mens prøvene i (B) ble kun behandlet én gang på grunn av de lave mengder tilgjengelig. 1 x PBS ble anvendt som prøvebuffer og gjenvinning av væske, med vann i bypasskanal for alle eksperimenter. Chip arbeidsfrekvenser varierte mellom 1,60 og 1,64 MHz, med drivspenninger mellom 16 og 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> For å demonstrere nytten av denne plattformen for biologisk partikkelseparasjon, vi først brukte den til å behandle velkarakteriserte biologiske prøver: menneske Raji celler (10 5 celler / ml, gjennomsnittlig diameter 8-10 mikrometer 25) tilsatt dengue virus (DENV, 10 5 pfu / ml, omtrentlig diameter på 50 nm). 26 Figur 7A viser den prosentandel av Raji-celler og DENV innsamlet i både SPO og LPO (definert som den fraksjon av hver partikkel typen samlet opp fra hvert utløp i forhold til den totale mengden av hver partikkel hentet fra chip). Forsøket ble gjentatt i triplikat, og Raji-celler ble kvantifisert ved anvendelse av en Coulter-teller, mens DENV ble kvantifisert ved anvendelse av en revers-transkripsjon kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR). Deretter ble ytelsen til systemet testes i et scenario som er mer realistisk for behandling av kliniske prøver, hvor de nøyaktige fysikalske egenskapene til partiklene kan være ukjent, og de tilgjengelige prøvemengder er lavere. Her vurderte vi separering av den nylig identifiserte Golden Gate virus (GGV), en slange patogener som infiserer boa innsnevrende nyreceller. 27 Størrelsen på GGV viruspartikkel har ennå ikke blitt målt, men siden GGV tilhører Arenaviridae familie, det er sannsynlig av entilsvarende størrelse, mellom 100 og 150 nm. 28 Vi behandlet prøvene med GGV piggete (10 4 PFU / ml) til Raji menneskeceller (ikke en infeksjon målet for virus), og boa nyreceller (infeksjon mål for GGV, omtrentlig størrelse 10 27 um) med begge celletyper 10 4 celler / ml. Som disse prøvene var tilgjengelig i små mengder, er atskillelse skyldes bare én forsøkskjøring rapportert i dette arbeidet. Figur 7B viser prosentandelen av Raji celler, Boa celler, og GGV hentet fra SPO og LPO. Celler ble kvantifisert i disse forsøkene ved å telle på en hemacytometer og virus ble kvantifisert ved RT-qPCR.

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice at JoVE.co

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

En mikrofluid Plattform for Precision Small-volum prøvebehandling og bruken til Size Separate Biologiske Partikler med en akustisk Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fabrikasjon av polymere og biohybridfibre med forhåndsdesignet størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell klemme som en robust, Microfluidic Intracellulær Levering Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En mikrofluid Chip for ICPMS Sample Innledning

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Fast Enzymatisk Behandling av proteiner for MS Detection med en Gjennomstrømning mikroreaktor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikrofluid plattform for High-throughput encellede Isolering og kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic Plattform med multiplekset Electronic Detection for Spatial Sporing av partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging roten håret morfologi av Arabidopsis frøplanter i en to-lags Microfluidic plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En Microfluidic plattform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En av beryllium gjennomstrømming Microfluidic plattform for enkeltceller genomet sekvensering

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...