Name: a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice
Uploaded: 2015-11-23T15:00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice at JoVE.co

This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL&#8217;s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo se presenta la integración a nivel de sistema de dispositivos de microfluidos para equipos macroescala para realizar el procesamiento de la muestra biológica automatizado. La modularidad de esta plataforma permite que sea adaptable a cualquier dispositivo de flujo continuo, y, como ejemplo, el protocolo presentado se centra en la caracterización y la optimización del rendimiento de un dispositivo de separación de partículas acoustofluidic. Tres ventajas principales de este protocolo se destacan: (i) la modularidad y chip a la interconexión mundial, (ii) la caracterización robusta del rendimiento del dispositivo, y (iii) el tratamiento automatizado de los volúmenes de las muestras medidas con precisión para la separación de partículas. yo. Modularidad y chip a mundo interconexión Como se muestra en la Figura 2, el chip de microfluidos está montado sobre un tablero a medida para adaptarse fácilmente a una platina del microscopio para la observación directa. El tablero contiene # 6-40 UNF agujeros roscados en una rejilla 5 mm de paso, enaBling el chip para ser asegurado, y las conexiones de fluido que se hará. Las conexiones de fluido se PEEK tubos con extremos mecanizados, que junta contra el chip fluídico con una cara de sellado de junta de goma y un collar de acero inoxidable. Este esquema de interfaz hace que para el reemplazo fácil chip y rápido rediseño dispositivo, que requieren pocos o ningún cambio en otros componentes del sistema, las huellas de chips suministrados cumplen con el formato de cuadrícula. Por ejemplo, hemos utilizado esta plataforma con chips de microfluidos para la electroforesis de flujo continuo, la lisis celular térmica, 29 mezclado rápido de los reactivos para la síntesis química, y la captura de una sola célula y el interrogatorio. ii. Caracterización robusta del rendimiento del dispositivo Con el fin de optimizar el rendimiento de cualquier dispositivo de separación de microfluidos, su funcionamiento primero debe caracterizarse completamente. El sistema descrito aquí apoya el desarrollo de protocolos rápidos y automatizados para hacer esto. Para el examp específicale de dispositivos acústicos de enfoque, la calidad centrándose, frecuencia de operación, y la posición de las partículas se centraron en el canal de microfluidos debe medirse para cada dispositivo individual. Estas medidas requieren barriendo a través de una gama de frecuencias de accionamiento piezocerámico, voltajes y velocidades de flujo, para identificar las combinaciones óptimas de los parámetros para la separación de alta calidad. El protocolo presentado varía automáticamente estos parámetros ajustables y captura la relevancia de datos, es decir, las imágenes fluorescentes de las partículas que fluyen en el canal que son post-procesado para generar las mediciones requeridas de partículas de enfoque de la calidad, la frecuencia y la posición (Figura 3). Caracterización completa del rendimiento del dispositivo acústico requiere repetir los pasos 4.4 y 4.5, según sea necesario en diferentes condiciones experimentales. Por ejemplo, la posición de enfoque absoluta de un chip se encuentra mediante la ejecución del barrido de frecuencias a velocidades de flujo relativamente bajas y alto voltajes para asegurar la migración completa a la ubicación de nodos. Además, tales exploraciones de frecuencia pueden evaluar la calidad de montaje de dispositivo (cuando se ejecuta con perlas de poliestireno de tamaño conocido), o para determinar cómo un tipo de partícula previamente desconocido se comportará en el sistema (después de un chip se ha caracterizado con los granos). Un chip con buena transferencia de energía desde el piezocerámico al canal de microfluidos se traducirá en apretada centrándose a velocidades de flujo altas (&gt; 1 ml / min) y los voltajes bajos (12-15 V PP), mientras que aquellos con transferencia de energía pobres no se centrará incluso a bajas velocidades de flujo (&lt;100 l / min) y altos voltajes (&gt; 20 V pp). Hemos encontrado que el contacto íntimo entre el chip microfluídico y el piezocerámico es crítico para la transferencia eficiente de la energía en el fluido. La investigación adicional del método óptimo de la unión del chip de microfluidos y el piezocerámico permitirá la producción fiable de dispositivos de alto rendimiento. Por último, una completala imagen de la operación de un dispositivo de acoustophoretic se puede obtener mediante la combinación de las mediciones de barrido de frecuencia basados ​​en imágenes de la Etapa 4 (y en la Figura 3) con recuentos de partículas recogidas de la SPO y LPO como funciones de los parámetros de funcionamiento pertinentes, a partir de los experimentos de separación llevadas a cabo con microesferas , como se describe en el Paso 5. Como se muestra en la Figura 6, una serie de experimentos automatizados, puede caracterizar rápidamente el rendimiento y la capacidad de ajuste de un dispositivo individual, informando al usuario del espacio óptimo de parámetros para operar el dispositivo para la separación de partículas. iii. Automatizado de procesamiento a pequeña muestra para la separación de partículas Para el procesamiento de muestra basada en chip microfluídico éxito y exacta, es crítico para metro, la carga, entregar de forma fiable y precisa, y recoger los volúmenes de fluido a medida que pasan a través. Esta precisión es especialmente importante cuando el volumen de muestra es pequeño(~ 0,1-1 ml), que es común en entornos de laboratorio clínico o de investigación. 30 manipulación de la muestra precisa es un reto en los experimentos de microfluidos tradicionales que emplean la retirada manual de la muestra en una jeringa y la infusión en un dispositivo sin votaciones de cuando la muestra se ha separado y cuando se debe recoger. El protocolo presentado emplea automatizado muestra bobina de carga y despacho junto con información en tiempo real de sensores de flujo para permitir separaciones reproducibles de pequeños volúmenes de muestra. La Figura 5 muestra los perfiles de flujo medido en la SPO y LPO de un experimento de separación típico. En primer lugar, tampón líder de al menos 35 l se carga para asegurar un flujo estable antes de la muestra alcanza el chip acústico. Los volúmenes de muestra de menos de 100 l no se recomiendan para esta configuración del sistema, debido a dilución de la muestra debido al tampón líder se hace excesiva. Un enchufe de aire se utiliza al principio de THe inyección antes de la memoria intermedia que conduce a separar el bloque de muestra del fluido que sigue, la prevención de la mezcla y dilución de la muestra y servir como un indicador para los sensores de flujo. Después de un transitorio inicial como el líquido comienza a moverse a través del sistema, las señales de punto sostenido en ambas salidas indican el paso de la primera burbuja de aire. Estos transitorios son seguidos por un largo período de flujo estable como la muestra fluye a través del sistema, y ​​luego otro pico cuando pasa la segunda burbuja de aire, y finalmente una disminución eventual de la tasa de flujo a cero después de la bomba se detiene jeringa. El paso de los tapones de aire a través de los sensores de flujo se utiliza como puntos de activación para cambiar las válvulas para iniciar y detener la recogida de muestras, minimizando así la muestra perdido y la dilución por volúmenes de fluido no muestra. Medición de bucle cerrado de los volúmenes de muestra procesada elimina la necesidad de volver a programar estos valores antes del inicio del experimento cada vez que se cambia la muestra de entrada. Esta característica esparticularmente importante cuando el volumen de muestra es limitado, por ejemplo en el caso de muchas muestras clínicas. Monitoreo de flujo en tiempo real también ayuda en la solución de problemas; una mala racha (por ejemplo, la formación de una obstrucción en uno de los puntos de venta) es inmediatamente evidente a partir de los perfiles de flujo resultantes, como en la Figura 5b. Para demostrar la flexibilidad y la eficacia de la separación acoustofluidic utilizando la arquitectura del sistema presentado, DENV purificado y reservas de virus GGV se clavó en acciones celulares y separados por el procesamiento a través del chip de microfluidos. Figura 7a muestra que las células Raji fueron bien separados, de los virus, como 97 % de las células Raji que salen del chip se encontró que en el LPO, dejando de ese modo una muestra altamente enriquecido de DENV en el SPO. En comparación, la eficiencia de la separación DENV fue menor, con 70% de DENV que sale el chip se encuentra en la SPO. Esto se puede atribuir a una ligera mezcla convectiva inducida por las vueltas de la separatien el canal, pero más probable que algunas partículas DENV que migran junto con las células Raji en el LPO. Las células que migran lateralmente a través de líneas de corriente arrastra un poco de líquido con ellos, incluso a bajo número de Reynolds. Por este mecanismo, así como la adsorción superficial no específica, las partículas virales de transferencia en la LPO. Sin embargo, la muestra altamente enriquecido de DENV en el SPO es un beneficio significativo, por ejemplo, cuando se utiliza la secuenciación de novo para detectar e identificar virus. La figura 7b muestra que en una carrera experimental, sólo alrededor del 70% de las células Boa que salen del chip se encontraron en la LPO, en comparación con casi el 100% de eficiencia de separación para células Raji. La diferencia en el rendimiento de separación entre los dos tipos de células puede ser atribuible a un tamaño medio menor o una menor densidad de células Boa comparación con las células Raji, por lo tanto, lo que resulta en fuerzas acústicas más pequeñas. Para confirmar o refutar estos supuestos, el tamaño, la densidad y morfología de Boacélulas en suspensión (que normalmente crecen adherente) de las células de la boa se deben medir con precisión, un esfuerzo para una mayor investigación. En los mismos experimentos, de manera similar a los experimentos con DENV, el grueso de la GGV recuperado salido del SPO, lo que indica un enriquecimiento de la fracción viral. Los datos presentados ponen de relieve los desafíos inherentes a la ingeniería plataformas de amplia aplicación para el procesamiento de una variedad de muestras biológicas. Es importante destacar que las interacciones biológicas pueden empezar a jugar tan grande un papel como los efectos físicos y mecánicos. Sin embargo, estos experimentos preliminares demuestran también el poder y la promesa de utilizar esta arquitectura del sistema para el procesamiento de muestras en aplicaciones clínicas y de investigación. Como sistema de ingeniería robusta, bien caracterizado, esta plataforma ofrece la posibilidad de buscar respuestas a nuevas preguntas científicas.

La separación de la muestra y el fraccionamiento es una de las áreas más prometedoras de la aplicación de las tecnologías de microfluidos. Tales etapas de manipulación de la muestra son esenciales para el diagnóstico eficaces clínicos, desarrollo de la terapéutica, los esfuerzos de biovigilancia, y los avances en investigación y tecnología ciencias de la vida. Una miríada de estrategias de separación de microfluidos se han demostrado para partículas y coloides de líquido suspendidas, así como para las especies químicas y biológicas; varios exámenes proporcionan una visión general de los recientes avances y desarrollos en estos campos 1 - 9. Aunque muchas de estas tecnologías de separación de microfluidos (en adelante como &quot;Dispositivos Core&quot;) se han caracterizado ampliamente, algunos informes han considerado el problema de la separación de la muestra a nivel de sistema. Los dispositivos básicos suelen ser los chips centímetro escala individual, interconectados con tubos de fluoropolímero, con fluido suministrado por una bomba de caudal o presión.Sin embargo, si la promesa de microfluidos - incluyendo una mayor automatización, fiabilidad y reducción de los volúmenes de muestra - es convertirse en realidad, al menos un esfuerzo equivalente debe dedicarse al diseño de un sistema de separación completa en la que se integra el Núcleo . Además, un gran desafío para los enfoques de microfluidos a biodetección es la macro a lo micro interfaz. Esto se refiere no sólo a las conexiones físicas &quot;del mundo a viruta&quot; de un dispositivo de microfluidos para componentes macroescala, ya la falta de coincidencia entre los volúmenes típicos de la muestra clínica o analítica (~ 0,1-10 ml) y el volumen interno de chips de microfluidos (~ 0,01-10 l), sino también a las limitaciones de muestreo estadístico derivados de la reducción de estas escalas de tamaño. Estos aspectos contribuyen a la percepción de que la muestra de pre-procesamiento y la preparación son el &quot;eslabón débil&quot; de biodetección. 10 La plataforma descrita en este trabajo takes importantes pasos hacia la solución de esos problemas. Desde una perspectiva a nivel de sistema, este protocolo se detalla el procesamiento fiable de los volúmenes de escala analítica precisamente-dosificadas (que van desde 0,15 a 1,5 ml) en ~ escalas de tiempo de 10 min. Esta es una operación de &quot;un botón&quot;: una vez que el vial de origen que contiene la muestra y de destino viales para la recogida de fracciones se colocan en el sistema, el comando &quot;ejecutar&quot; inicia el procedimiento, y todos los pasos son controlados por computadora. Al final de una carrera, los viales de recogida pueden ser retirados del sistema para el análisis de aguas abajo de las fracciones separadas. El dispositivo de Core en este sistema es un chip acoustophoresis que extrae partículas (5-20 mM) de células de mamífero de tamaño de la muestra. Separación Acoustophoretic se elige aquí principalmente porque es de alto rendimiento (hasta 100s de l / min), sin etiquetas y sin contacto, ofreciendo así ventajas en la separación de viru viableses a partir de células que pocas otras técnicas de microfluidos pueden igualar. La física de partículas acústica focalización se han descrito ampliamente, 11-13 y no son el foco de este protocolo, pero un breve resumen de los conceptos subyacentes de la siguiente manera para ayudar en la comprensión de la aplicación a la separación de microfluidos. Ultrasonido ondas estacionarias resonantes en microcanales llenos de líquido producen campos de presión, que dan lugar a las fuerzas que impulsan las partículas hacia los nodos de baja presión. La magnitud de la fuerza depende del volumen de la partícula, y en un factor de contraste acústico derivado de las densidades relativas y compresibilidades de la partícula y el líquido de suspensión. 14 Como tal, centrándose acústica es ideal para la separación de células de tamaño (~ 7-15 m) a partir de (~ de 50-200 nm) partículas similares a virus de tamaño. Las partículas más grandes migran hacia un nodo de presión; sin embargo, ya que la magnitud de la fuerza es muy pequeña paralas partículas más pequeñas de 2-3 micras, estas pequeñas partículas o especies disueltas casi no se mueven en absoluto. Nuestra implementación específica de separación acústica, como se describe anteriormente, 15 incorpora una pared delgada para subdividir el canal de fluido y permite sintonizable, la colocación asimétrica de la posición de enfoque. Esto añade flexibilidad en el diseño de dispositivos y los beneficios, incluyendo aumento de la calidad de desempeño de separación y velocidad se describen con detalle en otro lugar. 16,17 Sin embargo, una ventaja importante del enfoque de diseño a nivel de sistema se describe en este trabajo es que es adaptable a una gran variedad de dispositivos de núcleo de microfluidos. Por ejemplo, la mayoría de los otros modos de separación de flujo continuo, incluyendo inercial, el flujo de campo de fraccionamiento, el desplazamiento lateral determinista (sistema antibloqueo de frenos), y varios tipos de dispositivos electrocinéticos se pueden incorporar fácilmente, con los ajustes apropiados hechos para tener en cuenta cambios en la configuración de entrada / salida , caudales,y volúmenes de muestra. Los dispositivos con varios tipos de campos en-chip (eléctrica, magnética) o gradientes (térmicos, químicos) pueden requerir conexiones adicionales al chip, o la integración de hardware adicional, que da cabida a esta plataforma. Este protocolo proporciona los pasos necesarios para diseñar un dispositivo de separación de microfluidos, y para fabricar chips de silicio de cristal por una profunda grabado por iones reactivos (DRIE, un proceso de plasma de grabado disponible en muchas instalaciones de microfabricación, que utiliza ciclos de grabado y pasivación alterna para lograr profunda características con paredes laterales verticales 18). A continuación, se describe la caracterización del dispositivo acoustofluidic para determinar los parámetros de funcionamiento óptimas para la separación, y finalmente detalle el sistema de separación totalmente integrada y el procedimiento para el procesamiento de muestras biológicas. Resultados de la caracterización dispositivo típicos y procesamiento de datos de la muestra son luego presentados y discutidos, y de las ventajas clave de este aproada se destacan, incluyendo modularidad, robustez, precisión y automatización.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Polished Silicon Wafer</td>
			<td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td>100 mm &#60;100&#62;&#160; prime wafer</td>
			<td>1-20 ohm-cm, 495 +/- 25&#181;m Double-side polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wafer</td>
			<td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td>
			<td>100mmx0.5mm Boro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 1518</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 1518</td>
			<td>Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 4620</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 4620</td>
			<td>Photoresist to define fluidic and via mask patterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE plasma etcher</td>
			<td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td>
			<td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Bonder</td>
			<td>Electronic Visions Group,&#160; St.Florian am Inn, Austria</td>
			<td>EVG 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Kulicke &#38; Soffa Industries, Singapore</td>
			<td>K&#38;S 982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy kit</td>
			<td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td>
			<td>EPO-TEK 301</td>
			<td>Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT piezoceramic&#160;</td>
			<td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td>
			<td>PSI-5A4E</td>
			<td>37.5 &#215; 10 &#215; 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td>
			<td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td>
			<td>UL1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part silver epoxy&#160;</td>
			<td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td>
			<td>8331</td>
			<td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-edit</td>
			<td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td>
			<td>Ledit v15.1 64-bit</td>
			<td>CAD software for mask layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>PHD ULTRA Series, 703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringes</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer to Threaded port adapter</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Connects syringe to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-623</td>
			<td>Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.&#160; Can also use webbed&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160; 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-202</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; OD Fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1912L</td>
			<td>Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.&#160; Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03&#34; ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ID fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1476-20</td>
			<td>Used for Flow restrictors: 0.006&#34; ID, 1/16&#34; OD FEP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connects from chip to fluoropolymer tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling fan</td>
			<td>Multicomp, Leeds, England</td>
			<td>MC19663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF amplifier</td>
			<td>ENI, Rochester, NY</td>
			<td>325 LA</td>
			<td>Must be able to amplify signals from &#60;1V&#160; in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td>
			<td>CoolSnap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axiovert S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Tech, VT, USA</td>
			<td>SP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, 10x</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>ACHROPLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td>
			<td>TDS3014B</td>
			<td>To monitor voltage output by RF amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks, Natick, MA, USA</td>
			<td>R2014a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW</td>
			<td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td>
			<td>SITK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 &#181;m Beads</td>
			<td>Bangs Laboratory, IN, USA</td>
			<td>FS06F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Additional materials required for Step 5: Automated Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport valves</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>C25Z-3180EUHA</td>
			<td>In the current configuration 4 valves are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensors</td>
			<td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td>
			<td>SLI-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03&#34; ID</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1902L and 1912L</td>
			<td>High purity PFA preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160;</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZN1PK-10</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and valves.&#160; Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZGF1PK-10</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and valves.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td>LabVIEW Professional Development system</td>
			<td>Laboratory Automation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raji Cells</td>
			<td>ATTC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CCL86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boa Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Jose Pena at LLNL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Z2</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td>Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice

Una ventaja importante de dispositivos de microfluidos es la capacidad de manipular pequeños volúmenes de muestra, reduciendo así los residuos de reactivos y la preservación de la muestra precioso. Sin embargo, para lograr la manipulación de la muestra robusto es necesario para hacer frente a la integración de dispositivos con el medio ambiente macroescala. Para llevar a cabo la separación de partículas repetible, sensible con los dispositivos de microfluidos, este protocolo presenta una plataforma de microfluidos automatizada e integrada completa que permite el procesamiento preciso de 0.15-1.5 ml muestras utilizando dispositivos de microfluidos. Los aspectos importantes de este sistema incluyen el diseño modular del dispositivo y los accesorios sólidos resultantes en el mundo fiable y flexible a chip conexiones, y manejo de fluidos totalmente automatizado que lleva a cabo la recogida de muestras de bucle cerrado, la limpieza del sistema de cebado y medidas para asegurar un funcionamiento repetible. Diferentes dispositivos de microfluidos pueden ser utilizados de forma intercambiable con esta arquitectura. Aquí incorporamos un dispositivo acoustofluidic, detalle su characterización, la optimización del rendimiento y demostrar su uso para el tamaño de la separación de las muestras biológicas. Mediante el uso de información en tiempo real durante los experimentos de separación, recogida de muestras está optimizado para conservar y concentrar la muestra. Aunque que requiere la integración de múltiples piezas de equipo, las ventajas de esta arquitectura incluyen la capacidad para procesar muestras desconocidas sin optimización adicional del sistema, la facilidad de sustitución del dispositivo, y preciso, robusto procesamiento de la muestra.

Las principales características del diseño del dispositivo acústico de microfluidos se destacan en la Figura 1, y se describen completamente en otro lugar. 15 En resumen, de lado a lado el flujo de dos corrientes de fluido en un canal de separación, separado de un canal de derivación en paralelo por una pared delgada de silicio. Dado que la fuerza de radiación magnitud primaria escalas con el volumen de las partículas, las partículas grandes migran fuera de la corriente de entrada mixta de muestra hacia el nodo de presión acústica situado en la corriente de fluido de recuperación adyacente, mientras que las partículas pequeñas permanecen en el flujo original (Figura 1B, C). La arquitectura de dos canales subdividido mejora la separación de partículas 17 y permite el ajuste de la posición de nodo utilizando diferentes fluidos de canal de derivación. 16 El tablero de fluidos y accesorios proporciona una plataforma robusta para el mundo a chip conexiones, y el diseño modular permite el cambio rápido entre los chips de fluidos (Figura 2). Este configuration permite asimismo las conexiones de fluido reversibles, que sellan hasta 1.000 psi, a realizar de forma rápida y fiable (Figura 2B, E). Los resonantes de frecuencia f res de un chip se puede estimar mediante cálculos analíticos 1D simples (consulte el paso 1.1.1). A partir de un modelo de elementos finitos en 2D más completa de nuestra sección transversal del dispositivo, 16 la posición de enfoque de resonancia esperada para 2-nodo es 225 m de la pared y la frecuencia esperada es 1,68 MHz. Sin embargo, res f de dispositivos reales pueden variar en ± 100 kHz, dependiendo de la temperatura de funcionamiento y el acoplamiento de las resonancias longitudinales y laterales. Por lo tanto, después del montaje del dispositivo, res f deben ser verificadas empíricamente a caudales relevantes y tensiones de accionamiento piezoeléctrico, tal como se describe en el paso 4 del protocolo. La Figura 3 muestra las exploraciones de frecuencia representante tomadas a 200 l / min,<html> con agua en los principales canales y de derivación, y 20 V pp suministrada al piezo. Cuando el acoplamiento entre el piezo y dispositivo de microfluidos es bueno, las partículas se concentran fuertemente a la frecuencia resonante, lo que resulta en un pico claro en la intensidad de fluorescencia y la migración a la posición de enfoque se esperaba (Figura 3A). Por el contrario, cuando hay mal acoplamiento, partículas no se centran bien y los resultados del análisis de frecuencia serán similares a la figura 3B. En tales dispositivos, puede ser necesario volver a montar, si un adhesivo reversible se ha utilizado el transductor piezoeléctrico; de lo contrario, este dispositivo no es adecuado cuando se enfoca de alta calidad o de flujo rápido son críticos para la aplicación requerida. Los datos en la Figura 3 informan a la elección de la frecuencia de funcionamiento para los experimentos posteriores, y el voltaje y el flujo gama tarifa disponible para partículas separación eficiente. archivos / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. de tratamiento automatizado de la muestra. (A) Esquema de la muestra cargada en la bobina de la muestra. (B) perfil de flujo Representante de un experimento de la separación exitosa. (C) de flujo perfil de una separación ejecutar durante el cual la salida SPO obstruido aproximadamente a 220 seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Después de identificar los chips que son separadores eficaces, que se incorporan en el sistema representado en la Figura 4. Sistema total volumen de barrido se reduce al mínimo mediante el uso de tubos con 0,01 &quot;diámetro interior a lo largo de la trayectoria de flujo principal (líneas azules). La figura 5A ilustra el maquillaje de un tapón de muestra típica infundido a través del sistema. Se requiere una pequeña cantidad de &quot;tampón líder&quot; (~ 35 l) para precede la muestra en el flujo para eliminar las fluctuaciones de flujo mientras que la muestra se mueve a través del chip de separación. La Figura 5B muestra los datos de flujo resultantes de un exitoso experimento de separación acústica automatizado. Las principales características de una carrera exitosa incluyen: (1) un aumento transitorio en la tasa de flujo tanto en el LPO y SPO como se acumula presión y el fluido comienza a fluir a través del sistema, (2) un pico agudo que indica el paso de una burbuja de aire (la recuadro muestra un perfil ampliado de una sola burbuja), que debería llegar a la SPO antes de la LPO debido al flujo desigual de las dos salidas, (3) flujo estable a través de ambas salidas entre los dos burbujas de aire como la muestra se mueve a través del sistema, y (4) una disminución gradual en la velocidad de flujo en ambas salidas después de que el volumen de la muestra completa se entrega al sistema. Carreras problemáticas son inmediatamente evidentes a partir de perfiles de flujo similares a la figura 5C, donde aparece que la SPO se obstruyó después de aproximadamente 220 ​​segundos. En thi<html> s caso, un procedimiento de limpieza similar a la descrita en el Paso 5.3 se debe ejecutar para destapar el canal. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Figura afinabilidad 6. Dispositivo: Tamaño de partículas y efectos de tensión. Porcentaje de microesferas de poliestireno extraídos en el LPO depende del tamaño de partícula y la tensión suministrada al piezocerámico. Cada línea corresponde a una tensión de servicio diferente a la frecuencia resonante, determinado como se describe en el Paso 4. caudal total a través del dispositivo es de 200 l / min, con frecuencias de accionamiento aplicada entre 1,62 y 1,64 MHz. Las barras de error representan la desviación estándar de al menos tres experimentos separados. Reproducido y modificado con autorización de la Real Sociedad de Química de http://pubs.rsc.org / es / contenido / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La Figura 6 muestra los resultados de separación compilados utilizando diversos tamaños de partículas de poliestireno y piezoeléctricos conducir tensiones que demuestran los parámetros de funcionamiento necesarios para la separación eficiente. En general, se requieren voltajes más altos (es decir, fuerzas acústicas mayores) para extraer las partículas más pequeñas, como se esperaba. Voltajes del disco no se puede aumentar indefinidamente, sin embargo, debido a una mayor disipación de calor y el aumento de los efectos de la transmisión acústica. 13 El argumento sirve como una guía general para partículas tamaños separación de partículas que muestran significativamente diferente de recuperación a una tensión unidad específica (por ejemplo, 10- y las partículas de 2 micras, con 8,8 V pp) se separarán también. En general, las poblaciones de partículas con una diferencia de gran tamaño, tales como virus (~ 100 nm) y células (~ 10 m) se pueden separar rápida y eficazmente, al igual que las células de diffErent tamaños (por ejemplo, 6-8 micras eritrocitos discoidales y 8-15 micras leucocitos). Las condiciones específicas necesarias para trabajar con otros tipos de células tienen que ser determinado empíricamente, como la forma celular, la densidad y la compresibilidad afectar a su contraste acústico, además de tamaño de celda. Con este fin, los procedimientos en la Etapa 4 son útiles para determinar las condiciones de separación utilizables para cualquier nuevo tipo de célula o partícula, y no sólo para evaluar la calidad de un dispositivo acoustophoresis particular. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Figura 7. Separación de Eficiencia de Cell-Virus muestras adicionadas. Separación sea resultado de células Raji (A) con púas con el virus del dengue (DENV) y (B) células Raji y células de riñón de Boa pinchos con Virus Golden Gate (GGV). Los porcentajes recogidos se definen como la fracción de virus o células que salen de una específicala salida en comparación con la cantidad total que sale del chip. Las barras de error para (A) son la desviación estándar de 3 intentos, mientras que las muestras en (B) solamente se procesaron una vez debido a las bajas cantidades disponibles. 1x PBS se utilizó como fluido de tampón de muestra y la recuperación, con agua en el canal de derivación para todos los experimentos. Frecuencias de funcionamiento de viruta oscilaron entre 1,60 y 1,64 MHz, con tensiones de accionamiento entre 16 y 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Para demostrar la utilidad de esta plataforma para la separación de partículas biológicas, lo primero que usamos para procesar muestras biológicas bien caracterizados: células Raji humanos (10 5 células / ml, diámetro promedio 8.10 m 25) marcado con el virus del dengue (DENV, 10 5 pfu / ml, diámetro aproximado de 50 nm 26). Figura 7A muestra el porcentaje de células Raji y DENV recogidos tanto en el SPO y LPO (definida como la fracción de cada tipo de partícula recogido de cada salida en comparación con la cantidad total de cada partícula recogido del chip). El experimento se repitió por triplicado, y las células Raji se cuantificaron usando un contador Coulter, mientras que DENV se cuantificó usando una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). A continuación, el rendimiento del sistema se probó en un escenario que es más realista para el procesamiento de muestras clínicas, en las que las características físicas exactas de las partículas puede ser desconocida, y las cantidades de muestra disponibles son más bajos. Aquí, se evaluó la separación de la recientemente identificado virus puerta de oro (GGV), un patógeno serpiente que infectan células renales boa constrictor. 27 El tamaño de la partícula viral GGV aún no se ha medido, pero desde GGV pertenece a la familia Arenaviridae, que es probable de unatamaño similar, entre 100 y 150 nm. 28 Se procesaron muestras con GGV pinchos (10 4 pfu / ml) en células Raji humanos (no un objetivo infección para el virus), y células de riñón de boa (objetivo infección para GGV, tamaño aproximado 10 27 micras), con ambos tipos de células en 10 células / ml 4. Como estaban disponibles en cantidades bajas estas muestras, separación sea resultado de sólo una carrera experimental se presentan en este trabajo. Figura 7B muestra el porcentaje de células Raji, células Boa y GGV obtuvieron de la SPO y LPO. Las células fueron cuantificados en estos experimentos por contar con un hemocitómetro y los virus se cuantificaron por RT-qPCR.

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A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

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