Name: method of studying palatal fusion using static organ culture
Uploaded: 2015-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

The authors do not have any acknowledgements.

Alle beskrevne procedurer skal udføres i overensstemmelse med de retningslinjer og regler for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse af den lokale Institutional Animal Care og brug Udvalg. 1. Fremstilling af Dissecting Instrumenter og Kultur Medier <ol><li> Forvask alle instrumenter, der skal anvendes i dissektion med 3% hydrogenperoxid og derefter autoklave ved 121 ° C i 20 minutter. Filter BGJb medier med antibiotikum og antimykotisk løsning ved hjælp af en 0,22 um por...

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

Protokollen i denne artikel giver en metode til at dissekere palatinalt hylder fra embryoner på embryonale dag 13.5. Palatal hylder fra musefostre blev dyrket i et serumfrit dyrkningsmedier i en atmosfære af 95% O 2 5% CO2 ved 37 ° C. Vellykket palatal dissektion er kritisk afhængig af flere faktorer på hvert trin i proceduren fra embryonale tidspunktet for aflivet mus til færdiggørelsen af ​​kulturen. En af de vigtigste faktorer, der påvirker palatal fusion er den tid, det tager at starte orgel k...

Orofaciale kløfter er de mest fremherskende kraniofaciale fosterskader. Også, idet der i hensyn til alle mulige kraniofaciale defekter, disse er den næsthyppigste fødsel anomali hos nyfødte 2. Kløft ganer forekomme på cirka 1 ud af hver 700 fødsler i USA (US) hvert år, forekomsten af ganespalte er lig med 475 børn født med kløvede ganer om måneden eller 15 børn med kløfter per dag 3. Ca. 1% af børn født rundt om i verden hvert år udviser en form for kraniofacial dysmorfologi. Kløfter af ganen og læben har brug for et meget dyrt og kompliceret procedure med livslang konsekvenser for patienter, der har denne anomali. De anslåede omkostninger for hver patient med oral kløft er ca $ 100,000 4. Behandlingen af ​​en patient med læbe-ganespalte kræver et team af læger, herunder kraniofaciale kirurger, otolaryngologists, genetikere, narkoselæger,tale-sprog patologer, ernæringseksperter, odontologer, prosthodontists, psykologer, neurokirurger og øjenlæger. I palatogenesis, opstår den sekundære ganen som parrede udvækster, der oprindeligt vokser lodret og undergår palatal hylde højde over tungens dorsum. Efter elevation, de parrede palatinalt hylderne vokser mod midterlinjen (ved E14.5 -E15 i mus og uge 9 i mennesker). Den mediale kant epitel (MEE), som dækker hylden spids klæber danner midterlinjen epithelial søm. Dette efterfølges af epitelial til mesenkymale overgang og / eller apoptose at tillade mesenchymale konfluens. Vedhæftning af modsatrettede MEE er en vigtig begivenhed, hvis ændring forårsager ganespalte. Men kun få studier undersøgt den indledende vedhæftning af palatinalt hylder 5. Den hårde gane former af differentiering af mesenchymale celler i osteoblast. Den unormal udvikling af ganen kan producere nøglet ganer med eller uden inddragelse af læben. Ganen orgel kultur teknikker havde været anvendt bredt til mange laboratorier i de seneste 30 år 6,7. I denne protokol vi beskriver i detaljer en metode til palatal dissektion og statisk orgel kultur. Fordelen ved en ubevægelig organkultur er at det giver palatinalt hylder til at fusionere. Denne teknik er blevet anvendt med succes i vores laboratorium for mange fusion og signaler eksperimenter 8,9. Men omfanget af teknikken er enorme og kan bruges, når statisk orgel kultur-systemet er påkrævet, herunder evaluering af reaktioner på eksogene kemiske stoffer, virkningerne af regulatoriske vækstfaktorer i forskellige veje og specifikke proteiner. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figur 1. Mus Palatogenesis. Udviklingsmæssige stadier af mus ganen. (BF) Scanning electron mikrografer (SEM) af den sekundære ganen på repræsentative udviklingsmæssige gange. Røde pile: viser den første del af palatal vedhæftning og fusion. Gule pile: punkt til rummet mellem de primære og sekundære ganer, som vil forsvinde efter fusion (genoptrykt fra Kaufman 11 med tilladelse fra PLoS ONE).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

Læbe-ganespalte er blandt de mest almindelige af alle fosterskader. De sekundære ganen formularer fra mesenkymale hylder dækket med epitel, der klæber til at danne midterlinjen epitelial sømmen (MES). Teorierne tyder på, at MES celler følge en epitelial til mesenkymale overgang (EMT), apoptose og migration, hvilket gør en sammensmeltet ganen 1. Fuldstændig opløsning af MES er den sidste væsentlige fase af palatal sammenløb med omgivende mesenkymale celler. Vi tilvejebringe en fremgangsmåde til ganen organkultur. Den udviklede in vitro protokol tillader undersøgelse af de biologiske og molekylære processer i fusion. Anvendelserne af denne teknik er talrige, herunder evaluere svar på exogene, kemiske stoffer, virkningerne af regulerings- og vækstfaktorer og specifikke proteiner. Palatal organkultur har en række fordele, herunder manipulation på forskellige udviklingsstadier dette ikke er muligt ved hjælp af in vivo-undersøgelser.

Teknikken kan anvendes til forskellige former for experiments.The følgende undersøgelse blev designet til at teste den teratogene virkning af nikotin in vitro på palatal fusion. To stammer af mus blev anvendt til dette eksperiment blev CD1 og C57.Palatal væv behandlet med 0,06 og 6 mM koncentrationer af nikotin hemisulfat. Det blev observeret, at palatinalt fusion mønstre og timing var forskellige i de to forskellige stammer. I CD1 mus, palatinalt hylder fra kontrolgruppen fortsatte fusion i tidsafhængig ...

Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Undersøgelser af ganen udvikling er motiveret af forekomsten af ​​ganespalte, en misdannelse, der pålægger en enorm sundhed byrde og kan forlade varig vansiring. Vi demonstrerer her en teknik til kultur palatinalt hylder, som kan bruges til at studere forskellige signalveje der er involveret i udvikling og palatal fusion.

Metode til at studere Palatal Fusion hjælp Statisk Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur og Co-kultur Mouse æggestokke og ovariefollikler

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Studere Wnt Signaling Under mønster af ledende Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generation af Parabiotic zebrafisk embryoner ved Kirurgisk Fusion af Udvikling Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescens Farvning af Mouse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionalt Angiogeneseanalysesystem ved hjælp af co-Culture Sfæroider dannet af Endotelkoloni dannende celler og mesenchymale stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

En statisk selvstyret metode til generering af hjerneorganoider fra menneskelige embryonale stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Celle celle fusion af Genomredigerede cellelinjer til Perturbation af cellulær struktur og funktion

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...