Name: method of studying palatal fusion using static organ culture
Uploaded: 2015-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

The authors do not have any acknowledgements.

Alle procedures beschreven moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, met inbegrip van de voorafgaande goedkeuring door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Voorbereiding van ontleden Instruments en Cultuur Media <ol><li> VOORWAS alle instrumenten voor gebruik in dissectie met 3% waterstofperoxide en daarna autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. Filter BGJb media met antibiotica en antimycot...

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

Het protocol in dit artikel een werkwijze voor het ontleden palatal planken uit embryo&#39;s op embryonale dag 13,5. Palatini van muizenembryo&#39;s werden gekweekt in een serumvrij kweekmedium in een atmosfeer van 95% O 2 5% CO2 bij 37 ° C. Succesvol palatinale dissectie kritisch afhankelijk van meerdere factoren bij elke stap tijdens de procedure van de embryonale moment van de muizen gedood om de voltooiing van de kweek. Een van de belangrijkste factoren palatinale fusie is de tijd voor de orge...

Orofacial kloven zijn de meest overheersende craniofaciale aangeboren afwijkingen. Ook rekening houdend met alle mogelijke craniofaciale afwijkingen, dit zijn de tweede meest voorkomende geboorte afwijkingen bij pasgeborenen 2. Gespleten gehemelte optreden bij ongeveer 1 op elke 700 geboorten in de Verenigde Staten (VS) per jaar, de incidentie van gespleten gehemelte is gelijk aan 475 kinderen geboren met een gespleten gehemelte per maand of 15 kinderen met spleten per dag 3. Ongeveer 1% van de kinderen geboren in de wereld elk jaar vertonen een bepaalde vorm van craniofaciale dysmorfologie. Spleten van het gehemelte en de lip hebben een zeer dure en ingewikkelde procedure levenslange gevolgen voor patiënten die deze anomalie. De geschatte kosten voor elke patiënt met orale gespleten is ongeveer $ 100.000 4. De behandeling van een patiënt met schisis vereist een team van artsen, waaronder craniofaciale chirurgen, otolaryngologists, genetici, anesthesisten,spraak-taal pathologen, voedingsdeskundigen, orthodontisten, prosthodontists, psychologen, neurochirurgen en oogartsen. In palatogenesis de secundaire gehemelte rijst gepaarde uitwassen, die aanvankelijk verticaal groeien ondergaan palatale elevatie boven het dorsum van de tong. Na verhoging, de gepaarde palatal schappen groeien naar de middellijn (op E14.5 -E15 bij muizen en week 9 bij de mens). De mediale rand epitheel (MEE), die de plank tip dekt houdt zich het vormen van de middellijn epitheliale naad. Dit wordt gevolgd door epitheliale naar mesenchymale overgang en / of apoptose laten mesenchymale confluentie. Hechting van tegengestelde MEE is een belangrijk evenement waarvan wijziging veroorzaakt gespleten gehemelte. Echter, slechts weinig studies onderzochten de initiële hechting van palatal planken 5. Het harde gehemelte vormen door differentiatie van mesenchymale cellen in osteoblasten. De abnormale ontwikkeling van het gehemelte kunnen sleutel producerent smaakpapillen met of zonder betrokkenheid van de lip. Gehemelte orgelcultuur technieken werden op grote schaal gebruikt voor vele laboratoria in de afgelopen 30 jaar 6,7. In dit protocol beschrijven we in detail een werkwijze palatale dissectie en statische orgaankweek. Het voordeel van een bewegingloze orgaankweek is dat het mogelijk palatini fuseren. Deze techniek werd met succes gebruikt in ons laboratorium voor vele fusie-experimenten en signalering 8,9. Het toepassingsgebied van de techniek is enorm en kan worden gebruikt als statische orgaankweek systeem nodig en een evaluatie van respons op exogene chemische stoffen, de gevolgen van regulerende groeifactoren in verschillende trajecten en specifieke eiwitten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figuur 1. Mouse Palatogenesis. Ontwikkelingsstadia van de muizen gehemelte. (BF) Scanning elecTRON microfoto (SEM) van de secundaire gehemelte bij representatief ontwikkelingsstoornissen tijden. Rode pijlen: tonen de oorspronkelijke deel van palatale hechting en fusion. Gele pijlen wijzen op de ruimte tussen de primaire en secundaire fijnproevers die zal verdwijnen na fusie (herdrukt van Kaufman 11 met toestemming van PLoS ONE).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

Schisis behoren tot de meest voorkomende van alle aangeboren afwijkingen. De secundaire gehemelte vormen van mesenchymale planken bedekt met epitheel die voldoet aan de middellijn epitheliale naad (MES). De theorieën suggereren dat MES cellen volgen een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), apoptose en migratie, het maken van een gesmolten smaak 1. Volledige desintegratie van de MES is de laatste essentiële fase van palatal samenloop met omliggende mesenchymale cellen. Wij bieden een methode voor het gehemelte orgelcultuur. De ontwikkelde in vitro protocol maakt het onderzoek mogelijk van het biologische en moleculaire processen tijdens fusion. De toepassingen van deze techniek zijn talrijk, inclusief het evalueren respons op exogene chemische agentia, van regulerende en groeifactoren en eiwitten. Palatal orgelcultuur heeft een aantal voordelen, waaronder manipulatie in verschillende stadia van ontwikkeling die niet mogelijk is met in vivo studies.

De techniek kan worden toegepast op verschillende soorten experiments.The volgende studie werd ontworpen om de teratogene effecten van nicotine in vitro op palatale fusie te testen. Twee stammen van muizen werden gebruikt voor dit experiment, CD1 en C57.Palatal weefsel werd behandeld met 0,06 en 6 mM concentraties van nicotine hemisulfaat. Waargenomen werd dat palatinale fusie patronen en timing waren in de twee verschillende stammen. In CD1 muizen palatal planken uit de controlegroep bleef fusie in ti...

Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Studies van gehemelte ontwikkeling worden gemotiveerd door de incidentie van gespleten gehemelte, een aangeboren afwijking die een enorme gezondheid last oplegt en kunnen verlaten blijvende verminking. We tonen hier een techniek om cultuur palatini die kunnen worden gebruikt om verschillende signaalwegen betrokken bij palatinale ontwikkeling en fusie bestuderen.

Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Cultuur en co-cultuur van de Muis eierstokken en ovariële follikels

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Studeren Wnt Signalering Tijdens patroonvorming van Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generatie Parabiotic zebravis embryo&#39;s door Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgelcultuur en Whole Mount immunofluorescentiekleuring van Muis gangen van Wolff

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...