Name: method of studying palatal fusion using static organ culture
Uploaded: 2015-09-19T14:00:00
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Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l&#39;uso di animali vertebrati, tra cui l&#39;approvazione preliminare da parte del Comitato Istituzionale cura degli animali e l&#39;uso locale. 1. Preparazione di dissezione Strumenti e cultura dei media <ol><li> Prelavaggio tutti gli strumenti da utilizzare in dissezione con 3% di perossido di idrogeno e quindi in autoclave a 121 ° C per 20 min. Filtro mezzi BGJb con soluzione antib...

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

Il protocollo in questo articolo fornisce un metodo di dissezione scaffali palatali da embrioni al giorno embrionale 13.5. Ripiani palatali da embrioni di topo sono state coltivate in una coltura privo di siero in una atmosfera di 95% O 2 5% CO 2 a 37 ° C. Dissezione palatale di successo è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento embrionali dei topi sacrificati al completamento della cultura. Uno dei fattori più importanti che influenzano palatale fusione...

Schisi oro-facciali sono i difetti di nascita cranio-facciali più predominanti. Inoltre, prendendo in considerazione tutti i possibili difetti cranio-facciali, questi sono i seconda anomalia nascita più comune nei neonati 2. Labbro leporino si verificano in circa 1 ogni 700 nascite negli Stati Uniti (US) ogni anno, l&#39;incidenza di palatoschisi è pari a 475 bambini nati con labbro leporino al mese o 15 bambini con crepacci al giorno 3. Circa l&#39;1% dei bambini nati in tutto il mondo ogni anno mostra una qualche forma di dismorfologia cranio-facciale. Clefts del palato e il labbro bisogno di una procedura molto costosa e complicata, con implicazioni permanente per i pazienti che hanno questa anomalia. Il costo stimato per ogni paziente con schisi orale è di circa 100.000 $ 4. Il trattamento di un paziente con labiopalatoschisi richiede un team di medici, tra cui cranio-facciali, chirurghi otorinolaringoiatri, genetisti, anestesisti,discorso in lingua patologi, nutrizionisti, ortodontisti, protesisti, psicologi, neurochirurghi, e oftalmologi. Nel palatogenesis, il palato secondario si pone come escrescenze accoppiati, che inizialmente si sviluppano verticalmente e subiscono elevazione mensola palatale sopra il dorso della lingua. A seguito di elevazione, gli scaffali palatali appaiati crescono verso la linea mediana (a E14.5 -E15 nei topi e negli esseri umani settimana 9). L&#39;epitelio bordo mediale (MEE), che copre la punta mensola aderisce formando la cucitura linea mediana epiteliale. Segue la transizione epitelio mesenchimale e / o apoptosi consentire mesenchimali confluenza. Adesione di opporsi MEE è un evento essenziale la cui alterazione provoca palatoschisi. Tuttavia, solo pochi studi hanno esaminato l&#39;adesione iniziale dei ripiani palatali 5. Le forme palato duro di differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti. Lo sviluppo anormale del palato in grado di produrre cleft palati con o senza coinvolgimento del labbro. Tecniche di coltura di organi palato erano stati utilizzati ampiamente per molti laboratori nel corso degli ultimi 30 anni 6,7. In questo protocollo si descrive in dettaglio un metodo di dissezione palatale e della cultura d&#39;organo statica. Il vantaggio di una cultura organo immobile è che permette scaffali palatali di fondersi. Questa tecnica è stata utilizzata con successo nel nostro laboratorio per molti di fusione e di segnalazione esperimenti 8,9. Tuttavia l&#39;applicazione della tecnica è vasto e può essere utilizzato ogni volta che è richiesto sistema di coltura organo statico, compresa la valutazione della risposta agli agenti chimici esogeni, gli effetti dei fattori di crescita regolamentazioni di vari percorsi e proteine ​​specifiche. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figura 1. Topo Palatogenesis. Stadi di sviluppo del palato topi. (BF) ele Scansionemicrografie CTRON (SEM) del palato secondario, a volte sviluppo rappresentative. Le frecce rosse indicano: la parte iniziale di palatale adesione e fusione. Frecce gialle: punto per lo spazio tra i palati primarie e secondarie che spariranno dopo la fusione (ristampato da Kaufman 11 con il permesso di PLoS One).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

Labio-palatoschisi sono tra i più comuni di tutti i difetti di nascita. Le forme secondarie palato dagli scaffali mesenchimali coperti di epitelio che aderisce a formare la linea di giunzione linea mediana epiteliale (MES). Le teorie suggeriscono che le cellule MES seguono una epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), l&#39;apoptosi e la migrazione, per un palato fuso 1. Completa disintegrazione delle MES è la fase finale di essenziale palatale confluenza con circostante cellule mesenchimali. Forniamo un metodo per la cultura organo palato. Il protocollo sviluppato in vitro permette lo studio dei processi biologici e molecolari durante la fusione. Le applicazioni di questa tecnica sono numerosi, incluse le risposte di valutazione agli agenti chimici esogeni, effetti di fattori di regolazione e di crescita e proteine ​​specifiche. Cultura organo palatale ha una serie di vantaggi tra cui manipolazione a diversi stadi di sviluppo che non è possibile utilizzare in studi in vivo.

La tecnica può essere applicata a diversi tipi di experiments.The seguente studio è stato progettato per testare l&#39;effetto teratogeno della nicotina in vitro su palatale fusione. Due ceppi di topi sono stati utilizzati per questo esperimento, CD1 e tessuti C57.Palatal stata trattata con concentrazioni di nicotina emisolfato 0,06 e 6 mm. È stato osservato che i modelli di fusione palatali e tempi erano differenti nei due ceppi diversi. Nei topi CD1, mensole palatale del gruppo di controllo hanno continuat...

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Gli studi di sviluppo palato sono motivate dalla incidenza di palatoschisi, un difetto di nascita che impone un onere sanitario enorme e può lasciare deturpazione duratura. Si dimostra qui una tecnica per scaffali cultura palatali che possono essere utilizzati per studiare diverse vie di segnalazione coinvolti nello sviluppo del palato e fusione.

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