Name: method of studying palatal fusion using static organ culture
Uploaded: 2015-09-19T14:00:00
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Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o local. 1. Preparação de Instrumentos dissecação e Meios de Cultura <ol><li> Pré-lavagem todos os instrumentos a serem usados ​​na dissecção com 3% de peróxido de hidrogénio e, em seguida, em autoclave a 121 ° C durante 20 min. Filtrar meios BGJb com solução de antibi...

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

O protocolo neste artigo fornece um método de dissecação lâminas palatinas a partir de embriões no dia embrionário 13,5. Lâminas palatinas a partir de embriões de ratinho foram cultivadas num meio de cultura isento de soro, numa atmosfera de 95% de O2 5% de CO2 a 37 ° C. Dissecção palatino bem sucedido é criticamente dependente de vários factores, em cada passo durante o processo a partir do momento embrionário dos ratinhos sacrificados para a realização da cultura. Um dos factores ...

Fendas orofaciais são os defeitos de nascimento craniofaciais mais predominantes. Além disso, levando em consideração todos os possíveis defeitos craniofaciais, estes são a segunda anomalia nascimento mais comum em recém-nascidos 2. Fenda palatina ocorre em aproximadamente 1 em cada 700 nascimentos nos Estados Unidos (EUA) a cada ano, a incidência de fenda palatina é igual a 475 crianças nascidas com fissuras palatinas por mês ou 15 crianças com fissuras por dia 3. Cerca de 1% das crianças nasceram em todo o mundo a cada ano apresentam alguma forma de dysmorphology craniofacial. Fendas do palato e lábio precisa de um procedimento muito caro e complicado, com implicações ao longo da vida para os pacientes que têm essa anomalia. O custo estimado para cada paciente com fissura oral é de aproximadamente $ 100,000 4. O tratamento de um paciente com fissura labiopalatina requer uma equipe de médicos, incluindo cirurgiões craniofaciais, otorrinolaringologistas, geneticistas, anestesiologistas,fonoaudiológicas patologistas, nutricionistas, ortodontistas, prosthodontists, psicólogos, neurocirurgiões e oftalmologistas. Em palatogenesis, o palato secundário surge como conseqüências emparelhados, que inicialmente crescem verticalmente e se submetem a elevação prateleira palatal acima do dorso da língua. Após elevação, as lâminas palatinas emparelhados crescem em direcção da linha média (em E14.5 -E15 em ratinhos e em seres humanos semana 9). O epitélio borda medial (MEE), que cobre a ponta prateleira adere formar a costura linha média epitelial. Isto é seguido por epitelial para mesenquimal e / ou apoptose para permitir mesenquimais confluência. Adesão de se opor MEE é um evento essencial cuja alteração provoca fissura palatina. No entanto, poucos estudos investigaram a adesão inicial de 5 palatais prateleiras. As formas do palato duro através da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos. O desenvolvimento anormal do paladar pode produzir cleft paladares com ou sem envolvimento de lábio. As técnicas de cultura de órgãos paladar tinha sido amplamente utilizado para muitos laboratórios nos últimos 30 anos 6,7. Neste protocolo, descrever em detalhes um método de dissecção palatal e cultura de órgão estático. A vantagem de uma cultura de órgãos imóvel é que ele permite que lâminas palatinas para fundir. Esta técnica tinha sido usada com sucesso em nosso laboratório para muitos de fusão e de sinalização experimentos 8,9. No entanto, o âmbito da técnica é muito grande e pode ser utilizado sempre que sistema de cultura de órgão estático é necessário, incluindo a avaliação de respostas a agentes químicos exógenos, os efeitos de factores de crescimento em diferentes vias reguladoras e proteínas específicas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figura 1. Rato Palatogenesis. Estágios de desenvolvimento do palato camundongos. (BF) ELE Digitalizaçãomicrografias ctron (SEM) do palato secundário, por vezes, de desenvolvimento representativas. As setas vermelhas: mostrar a parte inicial da adesão palatal e fusão. Setas amarelas: Ponto para o espaço entre os paladares primárias e secundárias que irão desaparecer após a fusão (reproduzido a partir de Kaufman 11 com a permissão de PLoS ONE).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

A fissura labiopalatina estão entre os mais comuns de todos os defeitos de nascimento. As formas palato secundário de prateleiras mesenquimais cobertas com epitélio que adere para formar a costura linha média epitelial (MES). As teorias sugerem que as células MES seguir um epitelial para mesenquimal (EMT), apoptose e migração, fazendo um paladar fundido 1. Desintegração completa dos MES é a fase essencial final de palatal confluência com áreas células mesenquimais. Nós fornecemos um método de cultura de órgãos paladar. O protocolo desenvolvido em vitro permite o estudo de processos biológicos e moleculares durante a fusão. As aplicações desta técnica são numerosos, incluindo avaliando respostas aos agentes químicos exógenos, efeitos de fatores de regulação e de crescimento e proteínas específicas. Palatal cultura de órgãos tem um número de vantagens, incluindo a manipulação em diferentes fases de desenvolvimento que não é possível, utilizando estudos in vivo.

A técnica pode ser aplicada a diferentes tipos de experiments.The seguinte estudo foi concebido para testar o efeito teratogénico de nicotina in vitro em fusão palatino. Duas estirpes de ratos foram utilizados para esta experiência, CD1 e tecido C57.Palatal foi tratada com 0,06 e 6 mM concentrações de hemissulfato de nicotina. Observou-se que os padrões de fusão palatal e tempo foram diferentes nas duas estirpes diferentes. Em ratinhos CD1, lâminas palatinas do grupo controle continuou fusão no tempo ...

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Estudos de desenvolvimento palato são motivadas pela incidência de fenda palatina, um defeito de nascença que impõe uma carga tremenda de saúde e pode deixar desfiguração duradoura. Nós demonstramos aqui uma técnica para prateleiras palatinas cultura que podem ser utilizados para estudar diferentes vias de sinalização envolvidos no desenvolvimento do palato e de fusão.

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