Name: method of studying palatal fusion using static organ culture
Uploaded: 2015-09-19T14:00:00
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Todos los procedimientos descritos deben realizarse de acuerdo con las directrices y normas para el uso de los animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa del Comité local de Animal Institucional de Cuidado y Uso. 1. Preparación de disección Instrumentos y Medios de Cultivo <ol><li> Prelavado todos los instrumentos que se utilizarán en la disección con peróxido de hidrógeno 3% y luego autoclave a 121 ° C durante 20 min. Filtra medios BGJb con solución antibiótica y ant...

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

El protocolo en este artículo proporciona un método de disección palatinos de los embriones en el día embrionario 13.5. Palatinos de embriones de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% de O 2 5% de CO 2 a 37 ° C. Disección palatina éxito depende fundamentalmente de factores múltiples en cada paso durante el procedimiento desde el momento embrionario de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura. Uno de los factores más importantes...

Hendiduras orofaciales son los defectos congénitos craneofaciales más predominantes. Además, tomando en consideración todos los posibles defectos craneofaciales, se trata de la segunda anomalía de nacimiento más común en los recién nacidos 2. Paladar hendido ocurren en aproximadamente 1 de cada 700 nacimientos en los Estados Unidos (US) todos los años, la incidencia de paladar hendido es igual a 475 niños nacidos con paladar hendido al mes o 15 niños con hendiduras por día 3. Aproximadamente el 1% de los niños nacidos en todo el mundo cada año presentan algún tipo de dismorfología craneofacial. Las hendiduras del paladar y el labio necesitan un procedimiento muy costoso y complicado con implicaciones para toda la vida para los pacientes con esta anomalía. El costo estimado para cada paciente con fisura oral es de aproximadamente $ 100.000 4. El tratamiento de un paciente con labio leporino y paladar hendido requiere un equipo de médicos, incluyendo craneofaciales cirujanos, otorrinolaringólogos, genetistas, anestesiólogos,patólogos del habla-lenguaje, nutricionistas, ortodoncistas, protesistas, psicólogos, neurocirujanos y oftalmólogos. En palatogénesis, paladar secundario surge como excrecencias pareadas, que inicialmente crecen verticalmente y se someten a la elevación estante palatina sobre el dorso de la lengua. A raíz de la elevación, los palatinos pareadas crecen hacia la línea media (en E14.5 -E15 en ratones y la semana 9 en los seres humanos). El epitelio borde medial (MEE) que cubre la punta estante se adhiere formando la costura epitelial línea media. Esto es seguido por epitelial a mesenquimal transición y / o apoptosis para permitir la confluencia mesenquimales. Adhesión de oponerse MEE es un evento esencial cuya alteración provoca paladar hendido. Sin embargo, sólo unos pocos estudios investigaron la adhesión inicial de palatinos 5. Las formas de paladar duro por la diferenciación de las células mesenquimales en osteoblastos. El desarrollo anormal del paladar puede producir cleft paladares con o sin la participación del labio. Técnicas de cultivo de órganos Paladar habían utilizado ampliamente durante muchos laboratorios en los últimos 30 años 6,7. En este protocolo se describe en detalle un método de la disección del paladar y de la cultura de órganos estática. La ventaja de un cultivo de órganos inmóvil es que permite palatinos se fusionen. Esta técnica se ha utilizado con éxito en nuestro laboratorio para muchos de fusión y de señalización experimentos 8,9. Sin embargo, el ámbito de aplicación de la técnica es muy amplia y se puede utilizar siempre que se requiera el sistema de cultivo de órganos estática, incluyendo la evaluación de las respuestas a los agentes químicos exógenos, los efectos de los factores de crecimiento de regulación en diferentes vías y proteínas específicas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figura 1. Ratón palatogénesis. Etapas de desarrollo del paladar ratones. (BF) ele Escaneomicrografías ctron (SEM) del paladar secundario en tiempos de desarrollo representativas. Flechas rojas: muestran la parte inicial de la adhesión del paladar y la fusión. Flechas amarillas: punto al espacio entre los paladares de primaria y secundaria que desaparecerán después de la fusión (Tomado de Kaufman 11 con permiso de PLoS ONE).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

El labio leporino y el paladar se encuentran entre los más comunes de todos los defectos congénitos. Las formas de paladar secundario de estantes mesenquimales cubiertas de epitelio que se adhiere al formar la costura epiteliales de la línea media (MES). Las teorías sugieren que las células MES siguen un epitelio de transición mesenquimal (EMT), la apoptosis y la migración, haciendo un paladar fusionado 1. La desintegración completa de la economía de mercado es la fase esencial definitiva de confluencia del paladar y la zona células mesenquimales. Ofrecemos un método para cultivo de órganos paladar. La desarrollado protocolo in vitro permite el estudio de los procesos biológicos y moleculares durante la fusión. Las aplicaciones de esta técnica son numerosas, incluyendo la evaluación de las respuestas a los agentes químicos exógenos, efectos de los factores de regulación y de crecimiento y proteínas específicas. Cultivo de órganos Palatal tiene una serie de ventajas, incluyendo la manipulación en diferentes etapas de desarrollo que no es posible utilizando los estudios in vivo.

La técnica se puede aplicar a diferentes tipos de experiments.The siguiente estudio fue diseñado para probar el efecto teratogénico de la nicotina in vitro en la fusión palatal. Dos cepas de ratones fueron utilizados para este experimento, CD1 y el tejido C57.Palatal se trató con concentraciones mM de hemisulfato de nicotina 0,06 y 6. Se observó que los patrones de fusión palatinas y el momento eran diferentes en las dos cepas diferentes. En ratones CD1, estantes palatales del grupo de control continuaro...

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Los estudios sobre el desarrollo del paladar están motivados por la incidencia de paladar hendido, un defecto de nacimiento que impone una carga de salud tremenda y puede dejar la desfiguración permanente. Se demuestra aquí una técnica para estantes cultura palatinas que se pueden utilizar para estudiar diferentes vías de señalización implicadas en el desarrollo de paladar y la fusión.

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