Name: method of studying palatal fusion using static organ culture
Uploaded: 2015-09-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

The authors do not have any acknowledgements.

Alla förfaranden som beskrivs måste utföras i enlighet med de riktlinjer och regler för användningen av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande från den lokala Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Framställning av dissekera Instrument och Odlingsmedia <ol><li> Förtvätt alla instrument som skall användas i dissekering med 3% väteperoxid och sedan autoklav vid 121 ° C under 20 minuter. Filter BGJb media med antibiotika och antimykotika lösningen med en ...

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

Protokollet i denna artikel ger en metod för att dissekera palatala hyllor från embryon på embryonala dag 13,5. Palatal hyllor från musembryon odlades i ett serumfritt odlingsmedium i en atmosfär av 95% O2 5% CO2 vid 37 ° C. Framgångsrik palatal dissektion är kritiskt beroende på flera faktorer vid varje steg under förfarandet från embryonala tiden för euthanized mössen för fullbordandet av kulturen. En av de viktigaste faktorerna som påverkar palatal fusion är den tid det tar att s...

Orofaciala klyftor är de mest dominerande kraniofaciala missbildningar. Dessutom tar i beaktande alla tänkbara kraniofaciala defekter, dessa är de näst vanligaste födelse anomali hos nyfödda 2. Gomspalt förekommer vid ungefär 1 av 700 födslar i USA (US) varje år, är förekomsten av gomspalt lika med 475 barn som föds med gomspalt per månad eller 15 barn med klyftor per dag 3. Cirka 1% av barn födda runt om i världen varje år uppvisar någon form av kraniofaciala dysmorfologi. Klyftor av gommen och läppen behöver en mycket dyr och komplicerad procedur med livslångt konsekvenser för patienter som har denna anomali. Den beräknade kostnaden för varje patient med oral kluven är ungefär $ 100.000 4. Behandlingen av en patient med läpp- och gomspalt kräver ett team av läkare, inklusive kraniofaciala kirurger, otolaryngologer, genetiker, narkosläkare,tal språk patologer, dietister, ortodontister, protetiker, psykologer, neurokirurger och ögonläkare. I palatogenesis uppkommer sekundära gommen såsom parade utväxter, som initialt växer vertikalt och genomgår palatal hylla höjd ovanför dorsum av tungan. Efter höjd, de parade palatala hyllorna växer mot mittlinjen (vid E14.5 -E15 hos möss och vecka 9 hos människa). Den mediala kant epitel (ANM) som täcker hyllan spetsen fastnar bildar mittlinjen epitel sömmen. Detta följs av epitelial till mesenkymala övergång och / eller apoptos att tillåta mesenkymala sammanflödet. Adhesion av motsätta ANM är en viktig händelse vars förändring orsakar gomspalt. Men bara få studier undersökt initiala vidhäftningen av palatala hyllor 5. De hårda gom former genom differentiering av mesenkymala celler till osteoblaster. Onormal utveckling av gommen kan producera klavt smaklökar med eller utan inblandning av läppen. Palate organodlingstekniker hade använts i stor utsträckning för många laboratorier under de senaste 30 åren 6,7. I detta protokoll beskriver vi i detalj en metod för palatinal dissekering och statisk organkultur. Fördelen med en orörlig organkultur är att det tillåter palatinala hyllor att smälta. Denna teknik har använts med framgång i vårt laboratorium för många fusion och signaleringsexperiment 8,9. Men omfattningen av tekniken är omfattande och kan användas när statiskt organodlingssystemet krävs, inklusive utvärdering av svar på exogena kemiska medel, effekterna av regel tillväxtfaktorer i olika vägar och specifika proteiner. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figur 1. Mouse Palatogenesis. Utvecklingsstadier hos mössen gommen. (BF) Scanning electron mikrofotografier (SEM) av den sekundära gommen vid representativa utvecklings gånger. Röda pilarna: visa den första delen av palatal vidhäftning och fusion. Gula pilar: peka på utrymmet mellan de primära och sekundära gommar som kommer att försvinna efter fusion (omtryckt från Kaufman 11 med tillstånd från PLoS One).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

Läpp och gommen är bland de vanligaste av alla fosterskador. De sekundära gom blanketter från mesenkymala hyllor täckt med epitel som vidhäftar att bilda mittlinjen epitel sömmen (MES). Teorierna tyder på att MES celler följer en epitelial till mesenkymala övergång (EMT), apoptos och migration, vilket gör en smält gommen 1. Komplett sönderdelning av MES är den sista avgörande fasen av palatal sammanflödet med omgivande mesenkymala celler. Vi tillhandahåller en metod för gommen organodling. Den utvecklade in vitro-protokoll möjliggör studiet av de biologiska och molekylära processer under sammansmältning. De tillämpningar av denna teknik är många, bland annat utvärdera svar på exogena kemiska medel, effekter av reglerande och tillväxtfaktorer och specifika proteiner. Palatal organkultur har ett antal fördelar, inklusive hantering i olika utvecklingsstadier som inte är möjligt med in vivo-studier.

Tekniken kan användas för olika typer av experiments.The följande studie var utformad för att testa den teratogena effekten av nikotin in vitro på palatal fusion. Två stammar av möss användes för detta experiment, var CD1 och C57.Palatal vävnad som behandlats med 0,06 och 6 mM koncentrationer av nikotin hemisulfat. Det konstaterades att palatala fusions mönster och timing var olika i de två olika stammar. I CD 1-möss, palatinala hyllor från kontrollgruppen fortsatte fusion i tidsberoende sätt. Me...

Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Studier av gommen utveckling motiveras av förekomsten av gomspalt, en missbildning som innebär en enorm hälsa börda och kan lämna bestående vanställdhet. Vi visar här en teknik att odla palatala hyllor som kan användas för att studera olika signalvägar som är involverade i palatal utveckling och fusion.

Metod för att studera Palatal Fusion använder statiska orgel kultur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur och Co-kultur av Mouse Äggstockar och folliklar

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Studera Wnt Signaling Under Mönstring av ledande Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generation Parabiotic Zebrafish embryon genom kirurgisk Fusion utveckla Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ kultur och Hela Mount immunofluorescensfärgning av Mus Wolffian kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionellt Angiogeneshämningssystem med hjälp av Samkulturspheroider som bildas av Endotelkolonibildande celler och mesenkymala stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

En statisk självstyrd metod för att generera hjärnorganoider från mänskliga embryonala stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Cell-cell fusion av Genomredigerade cellinjer för perturbation av cellstruktur och funktion

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...