Name: modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging
Uploaded: 2015-09-18T14:00:00
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This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

모든 절차는 일리노이 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물 실험 동물 관리의 인증에 대한 미국 협회의 승인을 동물 보호 시설에 수용되었다. 모든 시도가 사용 동물의 수를 최소화하고 연구의 모든 단계에서의 고통을 감소시키기 위해 만들어졌다. 및 공격 태도를 보여준 마우스에서 뇌의 제거 1. 준비 <ol><li> 관류 및 슬라이스 배양을 ...

<ol>
	<li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse.">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li><li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+(barrel)+cortex+in+vitro.">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li><li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro.">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li><li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway.">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li><li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+thalamocortical+slice.">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li><li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus.">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li><li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons.">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li><li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat.">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li><li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms.">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li><li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Paradigm+for+Optical+Imaging:+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal.">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li><li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus.">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning.">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li><li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse:+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy.">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li></ol>

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

감각 주연부와 열등한 둔덕 간의 정보의 실질적인 처리가 있지만 그것이 청각 피질에 도달하기 전에 청각 시스템에서, 상당한 추가 처리가있다. 우리는 처리가 수행하고 변환 뇌가 들어오는 감각 정보를 해석 할 수 있습니다 방법에 대한 때문에 작은 방법에 대해 거의 알고있다. 후각을 제외한 각각의 감각은 초기 신호가 피질 상승으로 감소 높은 충실도로 중계되는 신호에 주연 매우 유사한 조직을 갖는다. 피질은 더 들어오는 정보를 조절하는 하부 구조에 대한 전망을 보냅니다. 이 복잡한 시스템은 생체 내뿐만 아니라 시험관 제제의 수가 다양한 방식으로 연구되어왔다. 전, 모든 연결은 감각 입력을 제어하고 측정하면서, 연결의 집합을 조사하기 위해 연구를 가능하게 그대로주어진 영역에서 출력. 이 방법을, 강렬 복잡한 출력 상승을주고, 다른 감각 입력, 각성,주의를 포함하여 다른 입력의 큰 다양성없이 제어에 거의 없다. 시험관, 뇌 조각이 하나의 세트를 캡처 잘라왔다 연구자들은 자극과 구 심성 또는 뇌 영역의 다양한 평가를 할 수 있도록 예측, 또는 두 개의 연결된 뇌 영역의. 이들은 종종 시상에 입력 또는 시상과 대뇌 피질에 출력 하나가 2-5 보존 thalamocortical 또는 tectothalamic 중 하나 조각입니다. 이러한 제제는, 약물, 전기 및 optogenetic 조작 다양한 허용한다. 그러나 두 개의 뇌 영역으로, 이들은 주로 정보의 전송을 평가하고 시상 통과함에 따라 정보의 변화를 평가하는 기능이 부족하다. 또한 주목 변조 역할을 세망 시상 투영은 6-9 인 PR이 조각에 ESENT. 여기에서 우리는 어떻게 시상 게이트 및 필터 정보의 독특한 관점을 제공하기 위해 시상에 다양한 입력의 연구자를 제어 할 수 있습니다 이전 준비 1시에 개선을 보여줍니다. 우리 커플 단일 세포 수준에서 다양한 입력의 영향을 측정하기 위해 슬라이스 연결 및 대규모 활성화 분석 뉴런 집단 분석 시상 칼슘 이미징 및 단일 세포 기록을 평가하기위한 flavoprotein 자기 형광 영상이 신규 슬라이스 제제. 이러한 광범위한 연결을 유지하는 데 도움을주기 위해 우리는 또한 강화 된 관류에 대한 슬라이스를 상승시키는 대신에 뇌 조각과 다리를 유지하는 일반 슬라이스 앵커 (일명 &quot;하프&quot;)의 수정을 개발했다. 하프는 슬라이스를 둘러싸고 하프 문자열에 대한 사용자 지정 부착 점 수 있도록 수정 된 말굽 모양으로 설계되어 있습니다. 세 개의 문자열은첨부 ⅰ) 하나 ⅱ) 하나가 AC의 꼬리 가장자리 IC의 꼬리 에지로부터 연장 ⅲ) 하나의 영역에 슬라이스의 내측 가장자리로부터 비스듬하게 연장되어, 슬라이스의 내측 가장자리를 따라 가로로 놓여 지도록 AC에 주동이 (도 1a 참조). 문자열 슬라이스 무결성을 유지할 수 있도록 슬라이스 압력 저하 량을 허용 하프 (시아 노 아크릴 레이트 접착제)을 붙이는 프레임에 작은 요철이 (도 1b 참조). 입체 인쇄를 사용하여, 우리는 조직의 상하 인공 뇌척수액 (ACSF)의 이상적인 흐름 수 있도록 우리 고유의 사양뿐만 아니라 다리에 사용자 정의 디자인 수금 할 수 있습니다. 이것은 또한 패치 클램프 전기 생리학의 조직에 침투하는 빛이 넓은 영역을 유지합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low calcium aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Lot: 1572C502</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td>Lot: 144912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Lot: 1499369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large culture dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-13</td>
			<td>100x15mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td align="right">353001</td>
			<td>35x10mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raised culture membrane</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMNIB</td>
			<td>470&#8211;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&#160; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium imaging fluorescence cube</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>BX-18</td>
			<td>XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for blocking brain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% by weight in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

P15 마우스에서 얻은 colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 예는 그림 2에 나타나있다. 이상적인 슬라이스 IC가 자극 될 때 모든 활성화 된 네 개의 주요 중뇌와 전뇌 청각 구조 IC, MGB, TRN, 및 AC를 포함합니다 (도 2A). 푸리에 분석을 사용하여, 상기 스펙트럼 전력은 주기적으로 자극 주파수 (10)에 혼입 인 활성을 나타내는 접속 뇌 영역과, 전기 자극의 주파수에서 측정...

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Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

연구

신경과학

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

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종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

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신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

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배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...