Name: protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells at JoVE.com

0315741: Biz Bu çalışma Eğitim ve Araştırma (BMBF) projesi Sanal Karaciğer Alman Federal Bakanlığı tarafından desteklenen Şekil 1&#39;de oluşturulmasında desteklerinden dolayı Jia Li Liu teşekkür etmek istiyorum.

Not: Tüm hücreler birincil ya da ikincil karaciğer tümörlerinde parsiyel karaciğer rezeksiyonu sonra kalan rezeke olmayan tümörlü insan karaciğer dokusu, izole edilmiştir. Universitätsmedizin Berlin - hastaların aydınlatılmış onam Charité etik kurallarına göre elde edilmiştir. Malzemelerin ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> izolasyon işlemi sırasında bakteri kontaminasyonu önlemek için önceden tüm enstrümanları ve malzemeleri sterilize edin. </li><li> Taze...

<ol>
	<li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells.">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , (2014).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li><li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells.">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li><li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes,+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity,+cell+signaling+and+ADME.">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man:+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo.">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li><li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research.">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li><li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity.">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li><li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity.">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li><li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing.">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li><li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G., Santin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Holy+Grail+of+Hepatocyte+Culturing+and+Therapeutic+Use.">The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use.</a> Strategies in Regenerative Medicine. , 1-38 (2009).</li><li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes,+Kupffer+cells,+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan.">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li><li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver.">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li><li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells.">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li><li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver:+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture.">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li><li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo.">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver.">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li><li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells.">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832 (2013).</li><li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody.">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li><li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation,+culture+and+characterization.">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis:+results+of+a+2-year+experience.">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver.">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li></ol>

yayınlanan protokol aynı zamanda insan karaciğer dokusunda aynı örnekten yüksek kalitede ve saflıkta, saf PHH ve NPC, yani KC, HSC ve LEC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Karaciğer hücre izolasyonları ile ilgili yayınlar çoğunluğu sadece insan dokusu ile gerçekleştirildi, bu hücre popülasyonu 18-20 ve izolasyon prosedürlerinin biri 21 (Damm ve ark., Tarafından) nadirdir kapsamaktadır. İnsan karaciğer hayvan dokusu (örneğin, sıçan karaciğer) i...

İnsan karaciğer dokusu son derece karmaşık ve iki farklı hücre varlıklar, parankimal hücreler ve non-parankimal hücreler (NPC) oluşur. Parenkimal karaciğer hücreleri hepatositleri ve cholangiocytes bulunmaktadır. Hepatositler toplam karaciğer hücrelerinin 60 70% temsil eden ve metabolik karaciğer fonksiyonlarının çoğu için hesap, örneğin, safra asidi ve faktör sentezi, metabolizma ve enerji metabolizmasını 2,3 tamamlayacak. Daha küçük NPC fraksiyonu toplam karaciğer hücrelerinin% 30-40 oluşturmaktadır. NPC farklı hücre popülasyonlarının, yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücrelerini (LEC) ve hepatik stellat hücreler (HSC) içerir. Bu heterojen hücre fraksiyonu karaciğer fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, NPC örneğin ilaç kaynaklı karaciğer hasarı (Dili) ve kronik karaciğer yaralanması, siroz 4 gibi akut karaciğer hasarı, aracılık katılabilir. Son yıllarda, Human karaciğer hücreleri karaciğer hastalıklarında daha önemli araştırma ve ilaç testleri, ilaç geliştirme ve yeni bir biyokimyasal yolların belirlenmesi gelişiminde olmuştur. İn vitro testler için PHH monokültürleri, hala &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir 5. Mevcut homotipik karaciğer modellerinde ana sınırlama birkaç gün 4 içinde farksızlaşma ve hepatositler fonksiyon kaybıdır. 3 boyutlu (3D) kültür teknikleri saptanması, bu sınırlama 4,6 telafi edilebilir olduğunu göstermiştir. Ancak, hatta modern 3D kültür teknikleri eylemlerin 7&#39;nin tüm hepatotoksik modlarını görüntülemek mümkün değildir. Mevcut in vitro modellerde eksik NPC popülasyonları in vivo duruma Bu farklılığın olası bir nedeni olarak tartışılmıştır. Aynı zamanda pathophy farklı karaciğer hücre popülasyonları arasında hücre-hücre iletişim fizyolojik homeostazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştirsiologic 8 işler. Bu nedenle bilimsel ilgi NPC ve hücre-hücre etkileşimleri üzerinde daha fazla duruluyor. Ko-kültür ve doku mühendisliği sistemlerindeki maksatlı kullanım mümkün olduğunca in vivo duruma kadar yakın, in vitro karaciğer modellerinin 8,9 yüksek talep için bir çözüm olabilir. Şu anda temel zorluk PHH ve NPC açıkça tanımlanmış bölümlerini içeren standart bir insan karaciğeri ko-kültür modeli, geliştirilmesidir. Sonuç olarak, çok heterojen karaciğer hücreleri için izolasyon teknikleri gerekli ve bu saf hücre popülasyonlarının kazanmak için optimize edilmiş olması vardır. PHH izolasyonu için standart protokoller 10 varken, insan NPC standartlaştırılmış izolasyon hala geliştirilme aşamasındadır. En yayınlanan NPC izolasyon protokolleri olmayan insan hücreleri 11,12 ile deneylere dayanmaktadır. Sadece birkaç yayınlar insan NPC izolasyon işlemini açıklar ve çoğu sadece kapakTek bir hücrenin izole edilmesi için yöntemler 11-16 yazın. Hücre ayrılması için kullanıldı edilmiştir en önemli hücre özelliklerinin boyutu, yoğunluğu, bağlanma davranışı ve yüzey proteinleri ifadesidir. Bu özellikleri temelinde biz Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 daha önce yayımlanan PHH, KC, LEC ve HSC, izole etmek basitleştirilmiş bir protokol geliştirmiştir. Çünkü bu teknikle geniş ilgi, bu makalenin amacı daha kolay tekniği üreten sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu. Protokol de verim ve canlılığının değerlendirilmesi için ve belirli immunostainings kullanılarak kimlik ve saflık değerlendirmesi için bir kalite kontrol yöntemleri içerir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">General Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:293px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PIPETBOY</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2-incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamin Air</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge Varifuge 3.0R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urine Beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2041101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">perfusor syringe 50 ml</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>12F0482022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bottle Top Filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>1058787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Culture plate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>533047</td>
			<td>24 well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">serological pipettes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>357525, 357551, 357543</td>
			<td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipette tips</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td>
			<td>100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isolation Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">water bath</td>
			<td>Lauda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peristaltic pump</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circulation thermostat</td>
			<td>Lauda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter</td>
			<td>Schott</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fine scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B&#252;chner funnel</td>
			<td>Haldenwanger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plastic funnel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silicone tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cannulae with olive tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>12068760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>Optic Labor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell lifter</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Drape</td>
			<td>Charit&#233; Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td>A2013027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">compress</td>
			<td>Fuhrmann</td>
			<td>40013331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sterile surgical gloves</td>
			<td>Gammex PF</td>
			<td>1203441104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue glue</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13349524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll Separating Solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L6145</td>
			<td>Density 1.124 g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s BSS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H00911-3938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15 - 002</td>
			<td>without Mg/Ca</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampuwa</td>
			<td>Plastipur&#160;</td>
			<td>13CKP151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49,361,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Pufferan&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>133196836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Media Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-005</td>
			<td>Low Glucose (1 g/l) (without L-Glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1135546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15 - 039</td>
			<td>without L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1137663</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">William&#8217;s E&#160;&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>32551-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">with GlutaMAX&#8482;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03780-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fortecortin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49367</td>
			<td>8 mg/2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human-Insulin</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td>100 I.E./ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment for Immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD 68</td>
			<td>R&#38;D Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK 19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>D2309</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK18</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>K2105</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFAP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23.472-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse IgG1-PE</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>C0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>L0412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1104509006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 4%</td>
			<td>Herbeta Arzneimittel</td>
			<td>200-001-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells

paren-kimal hepatositlerden yanında, karaciğer dışı parankimal hücreler (NPC), yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücreleri (LEC) ve hepatik yıldız şeklinde hücreler (HSC) oluşur. Birincil insan hepatosit (PHH) iki boyutlu (2D) kültürü hala ilaç metabolizması ve hepatotoksisite in vitro test için &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir. Bu PHH 2D monokültür, farklılaşmadan ve fonksiyon kaybına uğrar çok iyi bilinmektedir. Son zamanlarda karaciğer NPC karaciğer (pato-) fizyoloji merkezi bir rol ve PHH fonksiyonları bakım oynadığı gösterilmiştir. Mevcut araştırma 2D monokültürlere sınırlamaları aşmak için 3B ve ko-kültür modellerinde in vivo doku mimarisinin yeniden odaklanır. Daha önce insan karaciğer hücreleri izole etmek için bir yöntem yayınlanmıştır ve Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 hücre kültürlerinde kullanımları için bu hücrelerin uygunluğunu incelenmiştir. Bu te geniş ilgi dayalıBu yazının amacı chnique bu tekniğin kolay bir üreme sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu. Insan karaciğer hücreleri, iki aşamalı bir EGTA / kolajenaz P perfüzyon tekniği ile cerrahi müdahalelerin insan karaciğer doku örneklerinden izole edilmiştir. PHH 50 x g bir ilk santrifüj ile NPC ayrılmıştır. Yoğunluk gradyan santrifüj adımları ölü hücrelerin çıkarılması için kullanılmıştır. Bağımsız karaciğer hücre popülasyonları özel hücre özellikleri ve hücre sıralama prosedürleri kullanarak zenginleştirilmiş NPC fraksiyondan izole edilmiştir. PHH izolasyon yanında biz daha fazla ekimi için KC, LEC ve HSC ayırmak için başardık. Birlikte ele alındığında, sunulan protokol bir donör doku örneğinden yüksek kalite ve miktar PHH ve NPC izolasyonu sağlar. Saflaştırılmış karaciğer hücre popülasyonlarının erişim insan li gibi in vivo oluşturulmasına izin verebilirver modelleri.

yapışma özellikleri ve MACS kullanımı ile birlikte temizlik prosedürü olarak yoğunluk gradyan santrifüj kullanarak bir parankimal ve non-parankimal fraksiyonu içine ayrılık, başarılı PHH ve NPC izolasyona yol açar. PHH ve NPC yüksek kalite ve miktarda izole edilebilir. 1 karaciğer perfüzyon ve sindirim için ekipman temsilcisi kurulumunu göstermektedir. proteazlar proteolitik aktivitesini azaltmak ve karşılığında kolajenaz p akti...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells at JoVE.com

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neutrophil Isolation Protocol

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...